低温条件下小麦返白系叶片中H2O2累积的原因初探

肖 磊，杨 苑，李瑞航，谢利萍，邵景侠，郭蔼光,2，徐 虹,2

(1. 西北农林科技大学生命学院，陕西杨凌 712100； 2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100)

本研究用二甲基联苯胺(DAB)组织染色法测定返白系和矮变1号在4 ℃持续低温条件及25 ℃恢复培养下叶片H2O2的含量；同时测定低温处理下返白系和矮变1号幼苗叶片的叶绿素荧光参数，用qRT-PCR分析主要光合电子传递体基因以及清除质体活性氧相关酶类基因的表达量；分析返白系和矮变1号在低温处理下叶片H2O2的含量是否存在差异，并初步分析导致差异的生理与分子机制，以期为深入探究ROS与返白系叶色白化的相关性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

供试材料为冬小麦品种矮变1号和返白系，种子获赠于陕西省西安市农科所李丕皋研究员，由实验室长期保存。挑选整齐一致的小麦种子，在室温下用Hoagland营养液培养，长到一叶一心期时移至4 ℃低温人工气候箱中，培养条件：光暗周期16/8 h，有效光量子密度250 μmol·m-2·s-1，相对湿度70%，持续低温培养约90 d至返白系叶片全白，之后移至25 ℃人工气候箱培养10 d待叶片复绿。

1.2 小麦叶片中H2O2含量的检测

选取4 ℃低温处理0、5、10、20、30和90 d，以及25 ℃复绿培养2、5和10 d后的小麦倒一展开叶，将去除叶尖后剩余的长约2.5 cm、宽约1 cm的叶片放入DAB染色液(0.1% 二甲基联苯胺，0.1% Tween-20，用HCl调至pH5.6)中，避光染色24 h，之后将叶片放入脱色液(10%冰醋酸，10%丙三醇，用无水乙醇配制)中，加热煮沸10 min脱色，4 ℃放置过夜后在体式显微镜下观察拍照。

1.3 叶绿素荧光参数的测定

选取小麦幼苗的倒一展开叶进行测量。将小麦叶片平放在润湿的滤纸上避光30 min后，立即放进叶绿素荧光成像仪中进行测量，按照软件操作指南进行相关参数设定：Act1=20，Super=20，Shutter=20，Sensitivity = 40。选取叶片基部，用FluorCam Software 7.0软件分析小麦叶片的原初光能转化效率Fv/Fm、光化学淬灭系数qP的变化，每组处理测定3～5株小麦。

1.4 相关基因表达量的qRT-PCR检测

根据本实验室前期基因芯片检测数据，结合叶绿体基因表达谱，筛选出返白系与矮变1号中与光合电子传递、活性氧清除相关且表达有差异的基因。在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和GrainGenes(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)中比对这些基因，确定序列保守区域，用Primer Premier 5.0软件设计qRT-PCR引物(表1)。

表1 实时定量PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

以各组处理的小麦幼苗心叶为材料，Trizol法提取心叶总RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)说明书将总RNA反转录成cDNA。用ddH2O稀释cDNA样品至200 ng·μL-1左右，置-80 ℃备用。使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa，日本)，在公司CFX-96型荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)上以TaARF(ADP-ribosylation factor)基因为内参基因，检测基因的表达量变化。每个反应设置3个生物学重复，根据Ct值，利用公式2-△△Ct计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 低温处理与升温过程中返白系和矮变1号小麦叶片H2O2含量的动态变化

二氨基联苯胺(DAB)渗透到植物组织中后可与细胞中的H2O2迅速反应，生成红棕色联苯胺腙沉淀，红棕色程度深浅可以显示细胞中H2O2的含量。用DAB染色法，检测低温持续处理90 d的过程中，及升温复绿10 d过程中返白系叶片H2O2含量的动态变化，用矮变1号作为对照，结果如图1、图2所示。

图1显示，低温处理前，返白系与矮变1号幼苗叶片H2O2含量基本一致。4 ℃低温处理后，短期内(5和15 d)，矮变1号叶片H2O2含量无明显变化，长期(30和90 d)低温处理后矮变1号叶片的H2O2含量略有增加。与矮变1号相比，返白系叶片在低温处理5 d时颜色就有较明显加深，随着低温处理时间的延长，H2O2含量持续增加，在低温处理90 d叶片全白时，叶片已呈明显的红棕色，H2O2含量达到最高值。表明低温胁迫下返白系叶片中H2O2的含量明显高于矮变1号，持续低温引起了返白系叶片中H2O2的大量累积。

将低温处理90 d的小麦幼苗移至25 ℃培养，可使白化的返白系叶片在短时间内复绿。由图2看出，随着25 ℃培养时间的延长，小麦叶片的染色逐渐变浅，25 ℃培养下5 d的返白系叶片着色与低温处理5 d接近， 25 ℃培养10 d后叶片着色与低温处理前基本一致。说明叶片中H2O2的含量随着温度的上升迅速下降，直至恢复到低温处理前的水平，外界温度条件调控了返白系叶片中H2O2的含量。

2.2 低温处理下返白系和矮变1号小麦叶绿素荧光参数的变化

本研究采用了Fv/Fm和qP两个叶绿素荧光参数来反映返白系在低温条件下叶绿体光合电子传递能力。Fv/Fm是最大光化学量子产量，反映PSⅡ反应中心内有效光化学量子产量，即原初光能转化效率。逆境胁迫下Fv/Fm明显下降，是植物抗冷性的主要敏感指标。qP是光化学淬灭系数，表示由光合作用引起的荧光淬灭，反映了PSⅡ的天线色素分子将其所吸收的光能用于光化学电子传递的份额，也可反映PSⅡ原初电子受体QA的还原状态。Fv/Fm和qP值的降低会引起质体ROS的累积。

从图3可以看出，当低温处理30 d时，返白系表现出自叶片基部的黄化，对应区域的Fv/Fm和qP值低于矮变1号。当低温处理90 d时，返白系的叶片表现为全白，此时的Fv/Fm和qP也几乎检测不到。由此可知，低温胁迫下，返白系叶片的光合电子传递效率和光合活性低于矮变1号。

A:矮变1号；F:返白系。下图同。

图2 室温(25 ℃)复绿过程中小麦叶片H2O2含量的变化

2.3 低温处理下返白系和矮变1号小麦中与质体H2O2累积相关基因的表达模式

对4个光合电子传递体亚基基因ndhB、ndhK、petD和petN，以及4个质体H2O2清除相关基因APX4、tAPX、sAPX和HO1进行实时定量PCR验证，结果如图4和图5所示。

ndhB和ndhK是NDH复合体的亚基基因，petD和petN是Cytb6f复合体亚基基因，这4个基因都是由叶绿体编码。由图4看出，这4个基因对低温响应很敏感，短时间低温就可诱导4个基因的表达上调，ndhB在低温2 d表达量达到最大值，其他3个基因的表达量分别在低温10 d和20 d 达到峰值，之后则持续下调。温度回升后，基因表达量又逐渐上调。低温条件下，返白系中4个基因的相对表达量几乎都显著低于矮变1号，在低温处理30 d和90 d叶片全白时，返白系和矮变1号中4个基因的表达水平差异非常明显，这与图2中返白系叶片的Fv/Fm和qP值明显低于矮变1号相一致，光合电子传递体相关基因的表达水平低于矮变1号可能是返白系光合电子传递效率降低的部分原因。

图5显示，低温条件下，4个基因在返白系中分别表现为先上调再下调(APX4、tAPX和HO1) 或上-下-上的变化模式(sAPX)。矮变1号与返白系基本一致，但APX4基因在持续低温90 d时上调表达。说明这4个基因可以对低温做出积极的响应，但每个基因对低温的敏感程度和响应的模式不同。

Fv/Fm:最大光化学量子产量; qP:光化学淬灭系数。

比较两种材料基因的表达量后看出，低温处理前，在两个材料间除sAPX基因差异不显著外，其余3个基因均表现为返白系中的表达量显著高于矮变1号。返白系中的APX4基因在低温处理5 d、HO1基因在低温处理20 d后，相对表达量就一直显著低于矮变1号；至低温90 d时，除sAPX外的其他3个基因均是返白系中的表达量显著低于矮变1号。当温度升高至25 ℃后，返白系中除sAPX外的其他3个基因表达量均表现为上调，至25 ℃处理10 d时，4个基因在返白系中的表达量又都略微或者显著高于矮变1号。这些结果表明，相对于矮变1号，低温抑制了返白系中APX4与HO1的表达，返白系中APX4与HO1的低水平表达减弱了清除质体中过量H2O2的能力，这可能是长期低温条件引起返白系中H2O2累积的重要原因之一。

3 讨 论

低温会影响光合器官的结构和活性，影响光合电子传递和光合磷酸化过程[21]。本研究发现，低温处理下，相较于矮变1号，返白系叶片会累积大量的H2O2；通过测定低温处理下返白系和矮变1号叶片中表征光合电子传递效率的叶绿素荧光参数Fv/Fm、qP，发现随着低温处理时间的延长，返白系叶片中Fv/Fm、qP值明显降低，揭示出低温胁迫下返白系叶片的光合电子传递受阻，电子传递链效率降低，可能会发生严重的电子渗漏，并通过Mehler反应和SOD催化生成大量的H2O2。

进一步研究发现，低温处理下，返白系光合电子传递链中NDH复合体的亚基基因ndhB、ndhK以及Cytb6f复合体亚基基因petD和petN的表达量都显著低于矮变1号。NDH复合体和Cytb6f复合体是叶绿体中光合电子传递链中必不可少的组分和反应场所[22]，返白系中ndhB、ndhK、petD和petN较低的表达水平可能是低温处理下返白系中光合电子传递的效率明显低于矮变1号的重要原因，导致电子由PS中心流向NADP的途径受阻，产生电子泄露，并最终生成H2O2。

A：矮变1号；F：返白系。*和**分别表示在相同处理条件下返白系与矮变1号之间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下图同。

细胞中活性氧的浓度是由产生和清除两种途径控制的[10]。本研究对低温处理下返白系和矮变1号中质体H2O2清除相关基因APX4、tAPX、sAPX和HO1的qRT-PCR结果表明，在低温处理下，返白系中APX4和HO1的表达水平显著低于矮变1号。APX4和HO1在清除质体过量的H2O2上发挥着重要作用，其中APX是一种亚铁血红素蛋白，它以抗坏血酸为电子供体将H2O2分解为水，APX4可以与血红素结合, 具有抗氧化活性，能够清除叶绿体中的ROS[12]。过表达chlAPX和HO可以增强植物的抗氧化胁迫和抗逆性[14,23]。低温处理下返白系质体中APX4和HO1相对较低的表达量意味着低温处理下返白系质体(特别是基粒类囊体)中大量积累的H2O2不能得到有效清除，使得返白系质体中H2O2维持在较高的水平。一方面，低温处理下返白系中由于光合电子传递受阻，电子泄露，最终反应生成大量H2O2；另一方面，低温处理下，返白系中清除质体H2O2的关键酶APX4和HO1的表达水平较低，质体H2O2清除能力减弱，共同作用下导致了低温处理下返白系叶片中H2O2的大量累积。低温处理下返白系叶片累积的H2O2可能与低温诱导白化现象存在相关性，其对叶色白化的影响还有待于深入研究。

图5 质体H2O2清除相关基因表达分析