基于matK序列的婆婆纳属部分植物亲缘关系分析

许 静，赵月梅

(1.西安市第十中学，陕西 西安 710014；2.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

婆婆纳属(Veronica)植物属于玄参科，约有250个种[1]，广布全球，主产于欧亚大陆。我国有61种，各省均有分布，主产于西南山地。该属植物中，有外来杂草，如睫毛婆婆纳(V.hederifolia)、波斯婆婆纳(V.persica)；有传统药用植物，如水苦荬(V.undulate)、婆婆纳(V.didyma)等。具有止血活血，清热解毒，生肌，祛风利湿等功效[1]，本属植物多生于灌木丛、树林下以及河沟、山谷旁。

据《中国植物志》[2]记载，中国的婆婆纳属植物共分为8个组，分别为：穗花组、头花组、小婆婆内组、蚊母草组、婆婆纳组、沼生组、狭果组、疏花组。一般认为，除了狭果组外，其余种内和种间之间的界限均比较清楚。形态上鉴别婆婆纳属植物的方法主要为叶的形态，叶柄，花柄，果柄的长短，花的颜色大小，果的形态以及叶柄根的构造，叶片上下表皮的气孔数目等性状[3]。但是有些物种由于分布广，不同分布区环境存在差异，为了适应当地的生态环境，该物种的相关性状在不同类群之间会呈现不连续性。加上物种分化时间短，近缘物种之间存在基因流等原因，导致部分物种的种间关系比较模糊。因此仅依靠传统的形态学鉴别手段，很难对该属物种进行精确的区分[4～5]。

随着测序技术及分子生物学、分子系统学等学科的发展，在DNA水平上，利用合适的分子标记对近缘物种进行种间及种内序列分析，是解决物种间系统关系及分类的有效方法[6～10]。叶绿体matK基因是植物学系统分析中常用的序列之一，研究表明，该基因编码的酶参与RNA转录体中Ⅱ型内含子的剪切[11]，且由于该基因的变异较均一，在构建系统进化树时能提高聚类树的可靠性[11]，近年来广泛应用在了不同植物属内种间、种下的系统发育系研究[12-19]。研究拟利用matK基因分析婆婆纳属部分植物的系统发育关系，旨在探讨该属植物的在形态上难以解决的种间亲缘关系和分类界限，为该属植物的传统分类学及进一步应用和保护提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

本研究采用了婆婆纳属植物的16个种(36条matK序列)，其中婆婆纳，阿拉伯婆婆纳，北水苦荬样品采集自陕西商洛，其余13个物种的序列均从NCBI下载，上述3个物种的样品经野外采集新鲜叶片后，装入采集袋中用硅胶快速干燥，备用。

1.2 总DNA提取PCR扩增及序列测定

将婆婆纳、阿拉伯婆婆纳、北水苦荬三个物种的干燥叶片用天根公司植物DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech Co., China)提取样品总DNA。PCR扩增的引物及扩增条件及扩增体系参考以前研究成果[20]。扩增、纯化得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至上海生物工程技术服务有限公司进行单向测序。

1.3 数据分析

将测序所得序列和下载序列进行整理后构建FASTA格式的文件，用Clustal 2.0[21]软件进行比对后截掉前后多余的序列，组成长度一致的矩阵，备用。用Bioedit[22]软件和Mega6.0[23]软件进行序列变异位点的分析，并计算种间及种内距离，构建系统发育树。

表1 婆婆纳属样品来源

注：*表示该物种目前无中文名称

2 结果与分析

2.1 matK序列碱基组成分析

将得到的matK序列进行剪切，序列比对及后获得约733 bp长度的序列，发现该序列存在多处变异位点及1处插入缺失位点(图1)。其中序列中T、G、A、C的平均含量分别为36.9%、17.5%、28.9%、16.6%，变异位点167个，约占总序列的22.78%，整个matK区的变异位点丰富，可以较好地区分不同种质来源的婆婆纳属植物。

(1)在种内，其中婆婆纳、阿拉伯婆婆纳、北水苦荬、每条序列完全相同，即这些物种无种内变异:；睫毛婆婆纳在86位点发生了种内变异(A-G)；石蚕叶婆婆纳在667位点出现了变异(T-G)；有柄水苦荬在435位点出现了碱基缺失。

(2)在种间，睫毛婆婆纳、V.Spicata、V.Barrelieri、在148位点出现了变异(G-A)；阿拉伯婆婆纳、有柄水苦荬在624位点出现了变异(G-T)；小婆婆纳、睫毛婆婆纳、在624位点出现了变异(G-A)；石蚕叶婆婆纳在624位点出现了变异(G-C)。

图1 婆婆纳属16个物种matK序列信息

2.2 matK序列遗传距离分析

用Mega6.0软件计算的婆婆纳属16个种的种间遗传距离(表2)：16个婆婆纳属植物的遗传距离范围在0.002-0.101之间，其中1与15之间，即药用婆婆纳V.Officinalis和V.Dabneyi之间遗传距离最小，为0.002，表明二者亲缘关系较近，其次2(美洲婆婆纳V.Americana)与7(有柄水苦荬V.Beccabunga)之间、9(北水苦荬V.Anagallis-aquatica)与12(V.Catenata)之间、10(穗花婆婆纳V.Spicata)与14(V.Barrelieri)之间遗传距离都比较小，分别为0.003、0.003、0.004。另外，4(婆婆纳V.Polita)和8(睫毛婆婆纳V.Hederifolia)之间遗传距离最大，为0.101，表明二者亲缘关系最远。

表2 基于matK序列的婆婆纳属种间的K2P遗传距离统计结果

注：1-16个种的顺序同表1

图2为种间距离和种内距离的频率分布图，由此可知，matK序列在婆婆纳属中的种内距离集中在0%～0.5%区间，种间距离集中在0.5%之后，二者在0.5%～1.0%区间有少许重叠，且无论种内距离还是种间距离在该区间的分布都较少(小于10%)，表明matK序列在婆婆纳属的遗传距离分布上比较好：即种内距离偏小而种间距离偏大，适合做系统发育和分类分析。

图2 婆婆纳属植物种内、种间的遗传距离分布频度柱形图(其中横坐标为遗传距离，纵坐标为该遗传距离的分布频率)

2.3 系统发育分析

由Mega 6.0软件基于邻接法构建的系统发育树(图3)显示，16个种的36条序列能将每个物种分别聚成一个单系，且支持率较高。其中睫毛婆婆纳位于枝的最底端，表明该物种在该属中较为原始，与其他物种关系较远；剩下的分枝中，石蚕叶婆婆纳，婆婆纳和阿拉伯婆婆纳三个物种聚为一支，同时，剩下的12个物种聚为一支，二者形成并系，表明两个分枝间存在平行进化关系。在阿拉伯婆婆纳的分枝中，婆婆纳与石蚕叶婆婆纳关系较近，二者聚为一支，同时与阿拉伯婆婆纳形成并系；在12个物种形成的分枝中，形成2个亚分支，亚分支1：有柄水苦荬、美洲婆婆纳、V.Catenata、北水苦荬、蚊母草、小婆婆纳、V.Barrelieri和穗花婆婆纳聚为一个亚分支，其中，有柄水苦荬与美洲婆婆纳之间亲缘关系较近，V.Catenata与北水苦荬之间亲缘关系较近，蚊母草，小婆婆纳、穗花婆婆纳和V.Barrelieri依次关系较远。亚分支2：其余的物种V.Scutellata、药用婆婆纳、V.Dabneyi和V.Montana聚为另一个亚分支，其中V.Dabneyi和V.Montana关系较近，随后依次为药用婆婆纳、V.Scutellata物种。由此可知使用matK序列可以在系统发育上阐明婆婆纳属这16个物种的亲缘关系，且大部分分支支持率较高。

图3 基于matK序列的婆婆纳属系统发生树(注：1-16物种顺序见表1)

3 结论

本文利用matK序列分析了婆婆纳属16个物种(共36条序列)的系统发育关系，其中包括序列特征、K2P距离及系统进化树。结果表明：从实验过程上来说，野外采集的北水苦荬、婆婆纳和阿拉伯婆婆纳3个物种在DNA提取及PCR扩增过程中均表现良好，通用引物在该属这3个物种中均能正常使用，在上述的反应条件和反应体系均能很好的扩增条带并正常测序，表明这3个物种区段的引物结合区域未出现变异等情况，可正常结合并扩增。在采样不足的情况下，在Genbank中也有丰富的序列信息可供参考。从序列对比上来看，对比后的总长度为733 bp，相对于其他物种来说，序列长度属中等，1个插入缺失序列，167个变异位点，表明该属的物种进化较快。种内距离集中在0.5%以内，种间距离集中在0.5%以外，表明该序列在种内距离小在种间距离大，比较适合做系统发育分析。最后聚类树分析也表明该属物种中睫毛婆婆纳较为原始，阿拉伯婆婆纳、婆婆纳和石蚕叶婆婆纳与剩余的12个物种呈现平行进化趋势。

婆婆纳属植物分布广泛，在全世界各地均有分布，其中有重要的中药材，也有用于园林，环保等方面的重要植物，而该属植物多为草本，形态上有很多相似之处，因此在分类上造成了很多互相混淆的现象，尤其是广布于的婆婆纳和阿拉伯婆婆纳物种，在非花期和果期很难将二者进行准确的区分。而利用各种分子标记的方法则有助于在宏观分类方面区分这些形态上和进化上相似的物种，同时也可以阐明近缘物种间的复杂的系统发育关系，matK序列在该领域中是一种常用的序列，在很多药材及园林植物中都得到了重要的应用，本文的研究除了阐明婆婆纳属植物的系统发育关系外，同时能够为matK序列的应用范围和鉴定能力提供一个很重要的参考依据。