黄海聚球藻噬藻体S—H35基因组测序及分析

摘 要 用液体侵染法从黄海分离出一株能够侵染聚球藻WH8102的噬藻体S-H35。电镜检测结果显示，S-H35属于短尾科噬藻体。噬藻体S-H35的一步生长曲线显示其潜伏期约为4 h，爆发期约为8 h，裂解量为125。S-H35的基因组分析结果显示，其基因组长度为175， 321 bp，共含有228个ORF，GC含量为41.51%。基因功能分为噬藻体的结构、吸附相关、组装、DNA复制及修复、末端酶、与宿主生理活动相关的基因等。噬藻体S-H35与已知的噬藻体进一步的基因比对结果并未显示出明显同源性。

关键词 聚球藻 噬藻体 基因组

中图分类号：X52 文献标识码：A

聚球藻（Synechococcus）是海洋蓝细菌最主要的类群之一，也是超微型浮游生物中的优势组分，广布于世界各大洋，它们在海洋中丰度极高，在热带和温带海洋中的丰度通常在103～105个/mL。聚球藻能量转换迅速，在开放海域中的初级生产力可以达到总初级生产力的25%，是全球海洋中主要的初级生产者之一。此外，聚球藻是由2～4个单细胞组成的，具有结构简单、易于培养的特点，因此一直是研究病毒感染的理想宿主。

噬藻体（Cyanophage）是一类能够感染聚球藻、原绿球藻（Prochlorococcus）等蓝细菌的病毒，其基因组大小介于30～60 kb之间，直径一般在0.6～30 m之间。Safferman和Morris分离出第一株噬藻体“LPP”，它能够同时感染鞘丝藻（Lynbya）、席藻（Phormidium）和织线藻（Plevtonema）三种宿主。随后陆续有噬藻体纯株被分离，到目前为止，共有几百种不同的噬藻体被分离纯化，而海洋聚球藻病毒的研究开始于1990年，之后很多聚球藻病毒被分离和研究。

新的海洋噬藻体的发现，进一步丰富了海洋噬藻体库，并对进一步研究宿主-噬藻体之间的相互作用关系提供了实验基础。在本研究中，为海洋噬藻体基因库提供了新的基因组信息，并为维持海洋生态系统的稳定及防止藻类污染提供了新的线索。

1材料与方法

1.1材料

使用液体侵染法（原海水）分离噬藻体。

用于分离噬藻体S-H35的海水样品是采自中国北黄海海域H35站位（32？0N，122？2‘E）表层海水，采水量为1L。将水样经0.22 m的滤膜过滤两次，除去微微型生物及细菌，得到用于分离噬藻体的原海水；若病毒含量较低，用中型切向流将过滤后的海水浓缩100-1000倍，得到浓缩水样，置于4℃黑暗条件下保存待用。

1.2实验方法

1.2.1噬藻体的分离纯化

将原海水与处于对数生长期的聚球藻按照体积比1：9的比例混匀，置于25癈，1000 lux光照条件的智能光照培养箱中培养，1周左右可以观察到裂解现象。用双层平板法对噬藻体进行纯化，重复3次纯化实验，得到纯净噬藻体。

1.2.2噬藻体基因组的提取

液体侵染法富集病毒，用PEG浓缩法浓缩纯化病毒，用于后续实验研究（PEG浓缩病毒的方法参照Colombet等并加以改良）。

噬藻体基因组的提取方法具体参照Verheust等并加以改良。

1.2.3噬藻体的电镜观察

测定噬藻体的效价，当效价大于1010PFU/ml时，用移液器量取20 L的噬藻体样品加到铜网上，置于室温下15 min，加一滴2%的磷钨酸，染色10 min用于电镜观察。

1.2.4噬藻体的一步生长曲线

（1）将噬藻体与其宿主按照0.01的比例混合均匀。

（2）将加入噬藻体的聚球藻置于25℃，1000 lux持续光照的环境中培养，加入后即开始计时。

（3）在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時分别取样，并用25%的戊二醛进行固定。每个样品都设置三个平行样，分别测定后采用平均值。

（4）用流式细胞仪测定噬藻体的具体数值，以感染时间为横坐标，以感染体系中的噬藻体不同时间的浓度为纵坐标，绘制噬藻体的生长曲线，通过计算得出噬藻体的潜伏期、裂解期和裂解量。

1.2.5噬藻体的宿主专一性鉴定

用JYS Red、TB、RCC2673、RCC753、RCC556、RCC2535、RCC307、TE4、CCMP1333、SW、WH8109、TB3 winter、TB2 winter、TB1 winter、KSHK01C、Prasce syn、YOKATA BAY、b3、WH7803、WH8102、MW01、MW02、MW03、LTW Red1、LTW Red2、MW15、SC7、b23、LTW Green 、PSHK05、KSHK03、PSHK01、KSHK05共33株聚球藻进行宿主专一性鉴定。

1.2.6噬藻体的基因组测序

对浓缩纯化后的噬藻体高通量测序得到原始图像数据文件，经CASAVA碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），对测序数据进行过滤处理，去除包含Adapter的序列及低质量数据，得到的Clean Data用于后续分析。采用双端测序的方法，对基因组样品进行污染检测后进行基因组拼接，采用SPAdes软件进行序列拼接，得到原始Scaffold。基因组注释使用进行编码基因的预测，所采用的软件是GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/）。

2实验结果

2.1噬藻斑的观察

用双层平板法培养噬藻体S-H35，置于25℃，1000 lux的恒温光照培养箱中培养一周左右，即可观察到直径1 mm的半透明的噬藻斑，10天左右，噬藻斑的直径可以扩大到1～2 cm。

2.2透射电镜观察

S-H35尾部很短几乎不可见，因此推测属于短尾病毒科，头部直径约为40 nm（图1）。

2.3 S-H35的一步生长曲线

如图2所示，噬藻体S-H35的潜伏期约为4 h，爆发期约为8 h，裂解量为125。

2.4 S-H35的宿主专一性鉴定

侵染结果显示，S-H35除了能侵染聚球藻WH8102外，还能侵染聚球藻WH7803、LTW Red1和MW01，因此推测，噬藻体S-H35不具有种属特异性。

2.5 S-H35的基因组分析

噬藻体S-H35的基因组长度为175321 bp，共含有228个ORF，基因的平均长度为649 bp，基因总长度占基因组总长度的比为84.4%，GC含量为41.3%，tRNA个数为8个，rRNA为1个。

对其ORF进行预测，统计结果为228个，其中有21个（9.2%）是检索不到假定功能（putative function）的，在所有的ORF中，有74个（32.4%）能够检索到功能注释的结果，有133（58.3%）个ORF未能推测其功能。

S-H35的基因组中，基因的功能，大概可分为以下几类：噬藻体自身结构组成；DNA复制与修复、包装；末端酶；以及对宿主藻的生理活动起辅助作用的基因。

为了研究噬藻体S-H35的系统发生分析，利用蛋白软件和系统分析软件Mega6.06进行系统发生分析。由于S-H35属于短尾噬藻体，故选用短尾噬藻体的高度保守序列—DNA聚合酶基因所编码的蛋白序列与选定的噬藻体的序列用邻接法构建系统进化树。从图3中可以看出，S-H35与Synechococcus phage ACG-2014c及Synechococcus phage syn9在进化上的关系更近。

3討论

噬藻体的基因组比对分析结果显示，噬藻体S-H35跟其它噬藻体并未有显著相似性。这证明S-H35是从海水中分离得到的新噬藻体，S-H35的基因组序列信息对于以后噬藻体的分子生物学研究能够提供有用的基础信息。一步生长曲线显示，噬藻体的S-H35的裂解期较长，裂解量较大。

S-H35基因组中的基因大部分功能未知，但是从同源比对中可以发现，有3个（ORF88、ORF162、ORF181）与转录有关；2个（ORF23、ORF162）很可能与RNA的组装有关； 8个（ORF24、ORF39、ORF87、ORF129、ORF144、ORF148、ORF171、ORF185）可能与DNA复制和修复有关，ORF24编码DNA解旋酶，ORF39编码DNA甲基化酶，ORF85编码单链DNA结合蛋白；10个（ORF6、ORF52、ORF81、ORF133、ORF173、ORF191、ORF220、ORF221、ORF222、ORF228）与病毒包膜及结构有关；ORF228与病毒侵染循环有关；ORF148编码的是短尾科病毒的保守序列DNA聚合酶，能够保证噬藻体的基因组准确、迅速的复制以及产生更多的裂解后代。ORF143编码MazG基因，具有高度的保守序列；除去与自身繁殖功能有关的ORF，S-H35基因组中也存在对宿主细胞有着重要功能的基因，如ORF107可以编码光系ⅡD1蛋白，可以在宿主光系统受到强光损伤时，维持宿主的正常光合作用，满足其对能量的需要。电泳检测结果表明其为dsDNA，尾部很短几乎不可见，因此推测属于短尾病毒科。

核酸序列Accession Number：KY945241。

作者简介：徐霞霞，1991年1月，女，山东省烟台市人，中国海洋大学海洋生命学院2014级微生物学硕士，研究方向：海洋噬藻体。

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