HBV研究模型新进展

毕延伟，杨小强，#，孙平楠，周小玲，*

(1.汕头大学医学院干细胞P2实验室，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院生殖医学中心，广东 汕头 515041；3. 广东省感染病与分子免疫病理重点实验室，广东 汕头 515041)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是噬肝病毒属小包膜DNA病毒。乙型肝炎严重威胁人类健康，全球约有3.5亿乙肝病毒慢性携带者，每年约68.6万人死于乙肝病毒慢性感染[1]。中国是乙型肝炎大国，慢性乙肝病毒感染者面临较大的肝硬化和肝癌的风险[2]。现阶段治疗乙型肝炎的药物主要有两类：干扰素(如干扰素α/β等)和类核苷酸类药物(如拉米夫定、恩替卡韦等)。此外，HBV新药——多肽类药物 Myrcludex B[MyrB，HBV功能性受体钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的抑制剂]正处于II期临床实验阶段[3]。2012年，李文辉课题组证实NTCP作为功能性受体可以介导HBV及丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)进入肝细胞，为HBV相关研究开启了一扇崭新的大门。近年来干细胞技术的快速发展和应用，也有力的推动了HBV研究模型的发展。本文分别从病毒来源、细胞和动物感染模型等方面对HBV研究模型领域的进展进行总结。

1 感染用HBV的来源

1.1 患者血清来源的HBV

天然来源的HBV存在于乙肝患者血液中，HBV表面抗原(HBsAg)、E抗原(HBeAg)和核酸(HBV DNA)均可在其中检测到。由于HBV在人体中复制速度快且感染能力强，因此血清中HBV DNA的拷贝数达到很高水平。乙肝患者血清来源的HBV可反映肝脏HBV感染情况、患者体内HBV的血清型和基因型、肝组织中HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)和HBV DNA之间的关系。早期分类系统基于表面抗原(HBsAg)的抗原特性将HBV分为ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw3、adw4q-、adrq-和 adrq+等 10 种不同的血清亚型。其依据是：决定簇d/y和w/r的分子基础是表面抗原(HBsAg)第122和160号氨基酸残基的K/R转换，以及其他氨基酸位置决定w1～w4和q的反应性[4]。现已知的HBV基因型有A～J，该分型则是以全基因组测序序列不同进行划分，不同基因型之间核苷酸序列差异超过8%，因此比血清亚型分型方法更能反映病毒株之间的差异性。HBV基因型呈地理区域性分布，且不同基因型致病性不同。此外，HBV基因型与乙肝病情的临床表现、发生进展以及预后亦密切相关。

总体而言，乙肝患者血清来源的HBV具有DNA拷贝数高、感染力强等优点，是最接近天然状态的HBV。其缺点主要是乙肝患者血液来源有限，限制其应用于HBV的相关研究，而且经过抗HBV药物治疗后患者血液中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA会降低甚至消失，其中的病毒活力会明显下降。因此需要其他来源的HBV以替代天然来源的HBV。

1.2 体外细胞培养生产HBV

1.2.1 肝源细胞系生产HBV 稳定表达HBV的细胞系建立后被广泛应用。1987年，Sells等[5]通过将首尾相连的2倍HBV基因组整合进入HepG2细胞，从而构建成稳定表达乙肝病毒颗粒的HepG2.2.15细胞系。该细胞系中HBV可持续复制，能产生一定量的病毒感染颗粒，并能检测到cccDNA和松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的产生。其产生的病毒上清注射到黑猩猩体内可以诱发显著的肝炎症状。但该细胞系中HBV基因组是整合在细胞染色体上随细胞的复制而复制，复制方式与自然情况下不同且病毒复制量较低。随着培养代数增多，其细胞学特性与HepG2会有较大差异，主要抗原表达量会逐渐降低。

HepAD38是由HepG2细胞整合1.1倍的HBV全基因组构建而来，由CMV启动子和四环素(tetracycline，tet)及其衍生物诱导进行调控表达，由于其前C区基因被破坏，所以HBV DNA的产量比HepG2.2.15细胞要高很多[6]。HepAD79和HepG2-H1.3均整合了1.3倍的HBV全基因组，表达完全靠HBV自身启动子，更接近于病毒自然状态[7]。以上这几种细胞系均为在HepG2细胞染色体中整合不同长度的HBV基因组构建而成的稳定表达HBV的细胞系。

1.2.2 非肝源细胞系生产HBV 目前用于生产HBV的非肝源性细胞非常有限。人宫颈癌细胞系HeLa、小鼠成纤维细胞系NIH3T3等转染HBV基因组后可以产生HBV病毒颗粒，上清中检测到HBsAg、HBeAg、HBV DNA。但非肝源细胞装配和分泌的HBV颗粒与乙肝患者血清来源或肝癌细胞系来源的HBV颗粒有差异，产生病毒量少，且在储存过程中DNA容易降解，这些缺点束缚了该类细胞系用于HBV生产[8]。

1.3 HBV质粒瞬时转染生产HBV

综上，我们将HBV病毒的来源、构建方式、优点和缺点总结如下(见表 1)。

通过瞬时转染含HBV基因组的质粒是生产HBV另一方法。与稳定转染HBV的细胞系相比，瞬时转染的优点是操作步骤简单，省去了筛选细胞的步骤，转染速度快、培养时间短、转染率较高，因此安全性也相对较高。瞬时转染需要考虑两个因素：一是选择能够支持乙肝病毒表达和复制的细胞系，如肝癌细胞系HepG2，Huh7；二是合适长度的HBV质粒。采用的质粒都包括全长的HBV基因组，往往比HBV本身更长一些。HBV多种基因型大都包含ayw血清亚型，这可能是通常选用HBV的亚型ayw来进行研究的原因。表达HBV的质粒多采用含CMV强启动子的载体，如pcDNA3等，以启动下游基因的高表达。另有一些HBV质粒并不含外源启动子，完全依靠HBV自身启动子，病毒表达量比强启动子控制的质粒要低。瞬时转染HBV质粒后的细胞不适合长期培养[9-10]。

表1 HBV病毒来源比较

2 HBV感染模型

2.1 细胞模型

2.1.1 PHH/PTH细胞 人原代肝细胞(primary human hepatocytes，PHH)支持完整的HBV的感染及复制[11]，接近自然感染过程，是HBV感染研究的金标准。然而，PHH来源有限，不同捐献者的遗传背景差异性大[12]。而且PHH体外培养条件严格，难以大量扩增，随着培养时间的延长会较快去分化，丧失部分肝细胞特异性功能(如细胞色素P450水平降低)。这时，PHH的易感性和支持HBV复制的能力均降低[12]。研究表明，PHH体外培养易感性快速下降可能与NTCP的表达量下调有关[13]。树鼩原代肝脏细胞(primary tupaia hepatocytes，PTH)也可以支持HBV的体外感染。与PHH相比，PTH无论在细胞来源还是经济性方面都具有显著的优点。严欢等[14]利用PTH等细胞模型发现NTCP是HBV进入宿主细胞的功能性受体，表明PTH是稳定有效的HBV/HDV体外感染研究细胞模型。但PTH也同样面临感染效率不高、体外培养过程中对病毒易感性迅速下降等问题。

2.1.2 HepRG细胞 HepRG是一种人肝脏前体细胞系，来源于丙型肝炎引起的肝细胞肝癌女性患者的肝组织，是少数对HBV/HDV易感的细胞系之一[15-16]。当接种密度较低时，该细胞快速分裂并且呈现出一种狭长的未分化形态。但当加入DMSO和氢化可的松琥珀酸酯后，可以分化为两种类型的细胞：一种是呈现扁平状、具有清晰细胞质的胆管上皮样细胞，其周围则分布着另一种树突状肝样上皮细胞。与一般肝癌细胞系不同，高度分化的HepRG细胞的生物学特性(如细胞色素P450水平和天然免疫因子)很接近PHH，其转录组图谱与PHH也高度相似。能相对稳定的表达持续6周以上，即使停止DMSO诱导后细胞色素P450的表达水平降低，肝特异性转录因子和转运蛋白表达不受影响。HepRG细胞支持HBV的进入、基因组复制、cccDNA形成、感染性病毒颗粒分泌，适用于体外研究HBV生命周期的大部分阶段[15]。基于这些特点，HepRG细胞模型已成为一种公认的可以用于抗病毒药物研发以及评估的有效工具。然而，HepRG仍然有一些不容忽视的缺点，如感染前期DMSO诱导过程耗时长、感染效率不高。

2.1.3 HepCHLine-4和HLCZ01细胞 在NTCP发现以前，蒋严等[17]通过融合PHH和HepG2细胞，构建了一种支持HBV体外感染的新型细胞系HepCHLine-4，该细胞系染色体数目是PHH和HepG2细胞染色体数目之和。当用乙肝患者血清感染HepCHLine-4后，能检测到rcDNA、cccDNA和HBV颗粒的形成，HBsAg、HBeAg、HBcAg也均能检测到。在连续传代培养12个月后，该细胞系仍具有对HBV的易感性[17]。另外，Yang等[18]构建了一种能同时支持HBV和HCV体外感染复制全过程的新型肝癌细胞系HLCZ01。该细胞系分离自男性丙肝患者的肝脏肿瘤组织，实验人员通过两步胶原灌注法分离、纯化肿瘤细胞，然后挑选合适的克隆注射到NOD/SCID免疫缺陷的小鼠体内。两个月后，分离小鼠的肿瘤组织获得若干HLCZ01克隆后传代培养。用HepG2.2.15细胞上清和乙肝患者血清分别感染HLCZ01后，cccDNA和HBV上清标志物均被检测到。与HepRG不同，HLCZ01不需要DMSO诱导分化即可以支持长达90 d的病毒感染。该细胞系在HBV和HCV共感染时的相互影响、病毒感染时宿主应答机制、研究抗病毒药物或疫苗开发方面都有较大的应用潜力。

2.1.4 表达外源性NTCP的肝癌细胞系 NTCP是一种跨膜糖蛋白，具有钠离子依赖性转运胆汁酸盐的功能。2012年，李文辉等人发现NTCP是HBV和HDV感染进入肝细胞的功能性受体，NTCP在Huh7和HepG2细胞中的表达水平很低，约为PHH中表达量的1/10 000。Huh7和HepG2等人肝癌细胞系转染外源性NTCP后，可被HBV和HDV感染[19]。Ni等[20]通过HepRG分化和未分化两种形态对HBV的易感性进行的研究同样证实了NTCP的功能。基于此，研究人员通过构建稳定表达NTCP的肝癌细胞系，成功建立了可以支持HBV体外感染研究的细胞系(HepG2-hNTCP、 Huh7-hNTCP、 HepRG-hNTCP、 HEK293-hNTCP等)[14，19-22]。有意思的是，只有在HepG2和Huh7表达人源而非小鼠来源的NTCP时，才具有结合HBV的能力[20]。即人的NTCP包含了HBV表面蛋白PreS1所需的两个必要的氨基酸序列，其中第157～163号氨基酸序列是结合所必需的，第84～87号氨基酸序列是感染必需的。而鼠的NTCP缺少第84～87号氨基酸序列，因此不能被HBV感染[20]。用人NTCP中对应的氨基酸序列替代小鼠NTCP中这段关键序列后，小鼠NTCP即获得支持HBV感染的能力[21]。

HepRG表达NTCP水平相对稳定，但Schulze等[23]人发现减少HepRG细胞膜间的障碍以便HBV病毒颗粒可以充分与细胞基底侧膜接触，可以有效提高HBV的感染效率。Okuyamadobashi等[24]发现NTCP在HepG2-NTCP细胞的基底膜一侧而不是在细胞顶层膜，这限制了贴壁细胞的感染效率，因此发明了一种悬浮感染的方法，可以有效提高感染效率。因此，有效支持体外HBV感染的细胞系必须同时具备表达NTCP且NTCP处于可以与病毒颗粒接触的状态。

表达NTCP肝癌细胞系的建立为寻找HBV感染早期尤其是病毒进入过程中新的关键因子的发现奠定了基础。Verrier等[25]用HDV和表达NTCP的Huh7细胞系为模型研究病毒进入过程，发现肝细胞膜表面的GPC5是一种HBV和HDV的结合因子。Michailidis等[26]利用HepG2-NTCP感染模型，发现两种干扰素刺激基因IS G20、tetherin限制HBV宿主细胞间传递。Ko等[27]通过研究HepG2-NTCP细胞系发现DEAD盒RNA解旋酶家族成员DDX3是影响病毒复制的宿主限制性因素。

表达外源NTCP的肝癌细胞系也被用于筛选靶向作用于HBV进入的抗病毒药物。新发现很多小分子具有抗HBV活性，比如：环孢菌素A[22]、厄贝沙坦[28]等。Myrcludex B是一种人工合成的乙酰化PreS1短肽，可以结合NTCP从而阻断HBV/HDV 进入[20，29]。

稳定表达NTCP的HepG2和Huh7等肝癌细胞系虽然可以支持HBV感染，但感染效率不高(上清中产生的HBsAg和HBeAg水平都很低，甚至检测不到HBV DNA)，而用于感染的病毒液滴度甚至高达 6 000～18 000 GEq/cell[19-20，22]。Iwamoto等[22]构建了一株对患者来源和细胞来源的HBV都敏感的细胞HepG2-NTCP-C4。感染前用3%DMSO预处理HepG2-NTCP-C4细胞系，可以提高感染效率至50%。这提示了NTCP可能不是HBV进入过程的唯一受体或因子，DMSO诱导细胞分化可以使其他一些未知的分化依赖性宿主因子表达。因此，寻找病毒进入过程中的次级受体或因子也许是建立体外HBV高效感染模型的一个研究方向。

2.1.5 HLCs细胞 干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，可以在体外通过特定的条件诱导成为类肝细胞(hepatocyte-like cell，HLCs)。人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)、脐带基质干细胞(umbilical cord matrix stem cells，UMCC)等都可以分化成HLCs，研究证实HLCs支持HBV的感染和复制[30-32]。相比于其他的HBV体外感染模型，HLCs的优点是可以在体外批量生产、便于高通量筛选、可以具有不同的遗传背景、筛选个性化抗病毒药物等。间充质干细胞分化获得的类肝细胞具有成熟的肝细胞功能和分子标志物，Paganelli等[30]用HBV对其进行感染，在细胞的分泌液中检测到病毒颗粒和病毒蛋白，但病毒的复制效率低，优点是该细胞来源广泛，适用于HBV感染的早期研究。Xia等[31]诱导hESC和iPS成功分化为HLCs，90%分化后的细胞可以稳定表达PHH的标志物，如白蛋白、感染所需的特定细胞因子等，且NTCP的表达比PHH更稳定。用HBV病毒颗粒感染HLCs，HBV DNA、cccDNA、pgRNA、HBeAg和HBsAg都可以被检测到，并且应用该细胞系验证了2种宿主靶向抗病毒化合物：genistin和PA452[31]。然而干细胞培养和诱导分化成本高，诱导分化过程耗时长[33]。相信随着干细胞技术的不断发展，HLCs作为HBV体外感染模型将会有更加广阔的应用。

2.2 动物模型

2.2.1 黑猩猩模型 黑猩猩是理想的模拟HBV自然感染过程的动物模型。早在二十世纪六七十年代，科学家就已经发现黑猩猩可以被乙肝病毒感染。八十年代后，黑猩猩才被作为模型用来模拟HBV感染人的过程。黑猩猩与人类无论在遗传背景还是生理特征上都高度相似，因此该模型拥有独特的优越性。用HBV阳性患者血清感染黑猩猩后，可以使其产生急性感染和慢性感染，同时可以产生肝脏炎症以及与HBV感染患者相仿的免疫应答[34]。黑猩猩模型已经被用于HBV感染的发病机制研究、治疗性疫苗疗效评价、抗病毒药物筛选等。但使用黑猩猩模型进行研究的花费十分高昂，而且涉及动物伦理，限制了该模型的广泛使用。Dupinay等[35]近期报道一种生活在毛里求斯岛的食蟹猴，可被来自人类的HBV自然持续感染，可作为HBV感染动物模型。

2.2.2 树鼩模型 树鼩作为HBV感染的宿主被科研人员发现则是在二十世纪八十年代[36]。其外形与松鼠相似，成年后体长通常约140～195 mm，主要分布在中国西南省份和东南亚各国，属树鼩科树鼩属。但成年动物人工感染HBV后常表现为急性感染，感染HBV的树鼩肝组织中发现HBV DNA的复制，血液中也出现了HBsAg的表达，还能产生包括HBsAb和HBcAb在内的针对病毒抗原的抗体。幼龄期动物感染HBV较易形成慢性感染，与人类HBV感染过程相似。由于树鼩是野生动物，个体差异较大，实验重复性差。为了解决这个问题，我国学者组建了较大规模的人工繁育树鼩种群，深入开展了遗传学和基因组学相关研究，这些工作将促进树鼩成为可以广泛应用的HBV感染动物模型[37]。

2.2.3 人源化小鼠模型 将PHH移植到尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)转基因的免疫缺陷(SCID)小鼠中，该模型已经成功应用于HBV和HCV的感染，并且可以支持HBV生命周期的全部过程，但是与PHH一样，该模型也是一个特定基因型的有限原代肝细胞来源。该嵌合小鼠模型分离出的PHH表现出相当高的细胞色素P450酶和葡萄糖醛酸基转移酶活性。在PEG的作用下，80%的细胞可被感染，且上清中可以持续检测到HBV DNA。此外，将PHH移植到延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的小鼠(FRG)中，可使FRG小鼠中人肝细胞比例将达到95%[38]。虽然构建人肝嵌合小鼠模型费用高、步骤复杂，但可以将PHH扩增500～1 000倍，可提供较多对HBV高度易感的PHH；且获得具有单一基因型的肝细胞，减少了不同批次PHH差异性大的问题，增强了相关研究的可重复性和稳定性[39]。基于上述两种小鼠模型都是免疫缺陷模型，不适用于HBV感染过程中免疫应答相关研究。因此，有人提出通过多种策略构建人免疫细胞和人肝细胞双嵌合小鼠模型，如AFC8和A2/NSG小鼠模型[40]。这种模型能更好的模拟肝炎病毒感染过程中的免疫反应。

3 小结

HBV感染模型研究的发展对揭示病毒与宿主相互作用及反应机制等方面起了非常重要的作用，但仍有许多局限要克服突破。体外培养的PHH对病毒易感性低。HepRG细胞培养流程复杂，常常需要长达1个月以上的诱导分化过程。稳定表达NTCP的肝癌细胞系只能部分反映PHH的特性。各种细胞模型对感染时病毒滴度要求不一致，感染时使用了PEG和DMSO，不能真实模拟HBV感染人肝细胞时的侵入过程。现有的HBV体外感染细胞模型合成cccDNA的水平较低，而cccDNA是慢性HBV感染建立的关键，cccDNA在宿主细胞核内长期存在且目前没有可以将其有效清除的药物。作为筛选新的抗病毒药物的重要靶点，人们对cccDNA的认识十分有限，因此开发新的能够形成较高水平cccDNA的细胞模型，充分研究其形成和调节机制，尤为迫切。近年来HBV体外感染模型研究取得了令人瞩目的进展，一些新技术如干细胞技术的应用也为新的HBV体外感染模型提供了支持。研究显示人诱导多能性干细胞来源和人胚胎干细胞来源的HLCs其HBV感染率最高能达到90%，与PHH最高感染率100%最为接近，且HLCs感染后产生HBsAg和HBeAg的水平与PHH接近[41]。因此HLCs的应用为HBV感染研究提供了新的工具[32]。随着现有HBV感染研究模型的不断发展，以及新技术的应用，未来人们在乙肝病毒感染发生机制、病毒和宿主间的相互作用、新疫苗和抗病毒新药的研发等领域会取得更加丰富的成果。