超声波提取薏苡仁中总黄酮工艺及抗氧化活性的研究

李 志

（1.六盘水市山地特色生态产品研究中心，贵州 六盘水553000；2.贵阳海关出入境检验检疫技术中心国家果蔬检测重点实验室，贵州 六盘水553000）

引言

薏苡仁（CoixSeed）又名薏仁，属禾本植物，为药食同源植物，具有很高的营养与药用价值，被誉为“世界禾本植物”［1］。薏仁的主要功能活性成分为薏仁酯、薏仁素、薏仁活性多糖、三萜化合物、氨基酸、黄酮等，具有降血糖、抗肿瘤、抑制肥胖、提高机体免疫力、镇痛消炎、抑制骨质疏松等药理作用。其中黄酮为薏仁的主要活性成分，已有大量文献证实其具有抗肿瘤、抗氧化、预防癌症和抑制癌细胞扩增等多种功能活性［2-4］。黄酮类物质的提取一般采用热回流法或浸泡提取，但回收率均不理想［5］。近年来将超声波辅助提取法应用于植物细胞的破壁，有效地提高了有机物的吸收率，缩短了提取时间，提高了提取效率［6］。超声波辅助提取法是一种提取天然产物有效成分的新技术，它利用超声波产生的振动能量使细胞周围和细胞内的物质产生环流，有效提高细胞壁和细胞膜的通透性，从而强化萃取过程，有利于细胞内活性成分的提取［7］，还具有操作简单、提取速度快、污染少、成本低等优点［8］。响应面法（Response Surface Methodology，RSM）通过二次回归方程来拟合多因素与多个响应值之间的函数关系，将其运用到工艺参数的设计中时，可通过回归方程分析寻求最佳工艺参数［9］。

本试验以薏仁为原料、乙醇为提取剂，采用超声波来辅助提取总黄酮，通过响应面法优化黄酮的提取工艺，并进一步对其抗氧化活性进行了研究，为薏苡仁总黄酮的进一步开发利用提供方法和理论上的指导。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

薏苡仁购自贵州兴义市，选取颗粒饱满、无霉变的产品，经烘干、粉碎、过筛（80目）后，所得的薏仁粉经密封冷藏、保存备用。

乙醇、三氯化铝、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸铝、磷酸盐缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗败血酸（Vc）、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（1，1－diphenl－2－picrylhydrazyl，DPPH）等均为分析纯；芦丁标准品购于上海源叶生物科技有限公司。

1．2 仪器与设备

UV－2600／2700岛津紫外可见分光光度计，日本岛津公司；SCQ－9200C超声波清洗仪，上海声彦超声波仪器有限公司；AUX220分析天平，岛津企业管理（中国）有限公司；DH－2000R高速台式冷冻离心机，上海德洋意邦仪器有限公司；喆图TWS－12电热恒温水浴锅，上海喆图科学仪器有限公司；Retsch（莱驰）GM300专家型刀式研磨仪，弗尔德（上海）仪器设备有限公司；DHG－9140A电热鼓风干燥箱燥箱，上海楚定分析仪器有限公司。

1．3 方法

1.3.1 薏苡仁黄酮的提取

称取薏仁粉3 g置于150 mL茄型瓶中，加入85%的乙醇60 mL，在超声功率100 W、温度35℃下提取20 min。过滤，收集提取液，再向残渣中加入85%的乙醇60 mL，重复提取2次，合并提取液。提取液用旋转蒸发仪浓缩后，将浓缩液以5500 r／min的转速离心8 min，得上清液。从上清液中取10 mL置于100 mL容量瓶中，并用95%的乙醇定容至刻度，即得供试品溶液。

1.3.2 黄酮测定波长的选择

首先精密量取供试样品液7 mL置于25 mL容量瓶中，先加5%的NaNO2溶液1 mL，混匀，静置6 min，再加10%的Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，最后加入4%的NaOH溶液10 mL，用水稀释至刻度，放置20 min，在400 nm～720 nm波长范围内进行紫外－可见光区扫描光谱。

然后以芦丁为对照，称取芦丁标准品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，并用95%乙醇定容至刻度。接下来采取同上述供试样品液相同的方法来扫描芦丁的对照光谱。

测定结果发现芦丁标准品与供试品溶液均在波长510 nm处有最大吸光度，故选择510 nm作为薏仁黄酮的测定波长。

1.3.3 标准曲线的绘制

精密吸取1.0 mg／mL的芦丁标准溶液0 mL（空白）、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL置于10 mL容量瓶中，加95%的乙醇定容至10 mL，按1.3.2节的方法进行操作，在波长510 nm处测定吸光度。然后以吸光度为纵坐标、芦丁的质量浓度为横坐标来制标准曲线，并得到线性回归方程为：

y＝0.0014x＋0.0138，R2＝0.9998 （1）

1.3.4 样品中总黄酮得率的测定和计算［10］

将样品液测得的吸光度代入式（1），通过计算得到样品液中总黄酮的质量浓度C（g／mL），然后通过下面的式（2）计算黄酮得率。

黄酮得率＝（C×V1×V2）／（M×V3）×100% （2）

式中，V1－测定液的定容体积，mL；V2－提取液的定容体积，mL；M－样品质量，g；V3－测定时量取的体积，mL。

1.3.5 黄酮提取工艺的实验设计

1.3.5.1单因素实验设计

（1）乙醇浓度对黄酮得率的影响

精密称取2.00 g烘干至恒重的薏苡仁粉5份，在料液比为1∶20（g：mL）、提取时间为20 min、超声功率为100 W的条件下，各份分别用70%、75%、80%、85%与90%体积分数的乙醇提取（重复3次浸提，以下同），并计算黄酮得率。

（2）提取时间对黄酮得率的影响

精密称取2.00 g烘干至恒重的薏苡仁粉5份，在料液比为1∶20、超声功率为100 W、乙醇体积分数为85%的条件下，各份分别进行超声提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，并计算黄酮得率。

（3）料液比（g：mL）对黄酮得率的影响

精密称取2.00 g烘干至恒重的薏苡仁粉5份，在乙醇体积分数为85%、提取时间为40 min、超声功率为100 W的条件下，各份分别在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比下提取，并计算黄酮得率。

（4）超声功率对黄酮得率的影响

精密称取2.00 g烘干至恒重的薏苡仁粉5份，在乙醇浓度为85%、提取时间为40 min、料液比为1∶25的条件下，各份分别在100 W、150 W、200 W、250 W、300 W的超声功率下提取，并计算黄酮得率。

1.3.5.2响应面试验设计

根据Box－Behnken的中心组合试验设计原理［11］，以单因素试验结果为参考依据，选取乙醇浓度、提取时间、料液比、超声功率四个因素为自变量，以黄酮得率为响应值，采用四因素三水平的响应面来优化这些因素，每个试验组重复3次，取其平均值。试验因素水平及编码见表1。

表1 响应面分析的因素水平及编码

1.3.6 抗氧化活性的测定

1.3.6.1还原能力的测定

薏苡仁黄酮还原能力的测定参照Vaquero等［12］的方法进行。取五支15 mL的试管，分别加入不同质量浓度（0.1 mg／mL、0.3 mg／mL、0.5 mg／mL、0.7 mg／mL、0.9 mg／mL）的样品溶液2.5 mL，然后加入2.5 mL的磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol／L，pH 6.6），加入1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀，置于50℃水浴锅中反应20 min，最后再加入10%的三氯乙酸2.5 mL，摇匀，转入离心管中并在5000 r／min下离心8 min，取上清液4 mL置于15 mL试管中，并向其中加入3 mL的去离子水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，摇匀反应8 min，在700 nm处测其吸光度（以Vc为对照品），吸光度越大表明还原力越强。1.3.6.2 DPPH自由基清除试验

薏苡仁黄酮对DPPH自由基的清除试验参照薛菁等［13］的方法进行。

（1）分别取3 mL不同质量浓度的薏仁黄酮试样溶液，加入由无水乙醇配制、浓度为0.2 mmol／L的DPPH溶液1 mL，摇匀于黑暗处静置30 min，测定其在517 nm波长处的吸光度（用无水乙醇调零），记为A试验。

（2）空白组用3 mL无水乙醇代替试样溶液，其他操作与上述（1）中相同，测定吸光度，记为A空白。

（3）对照组用1 mL无水乙醇代替DPPH溶液，其余处理与（1）中的试样溶液相同，测定吸光度，记为A对照，并以相同质量浓度梯度的Vc溶液作对照实验。

清除率的计算公式为：

DPPH自由基清除率（%）＝［1－（A试验－A对照）／A空白］×100

2 结果与分析

2．1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

乙醇浓度对黄酮得率的影响如图1所示。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

从图1可知，随着乙醇浓度的提高，黄酮得率先随之升高，当乙醇浓度为85%时，黄酮得率达到最大值，继续增加乙醇浓度，黄酮得率反而有所下降。这种情况一方面是黄酮化合物的水溶性引起的，当乙醇浓度过高时，使得黄酮类化合物不能充分溶解；另一方面是因为过高浓度的酒精使细胞中蛋白质凝固，凝聚堵塞组织微孔，阻碍了黄酮的溶出，故提取得率下降［14］。试验结果说明乙醇浓度选85%为宜。

2.1.2提取时间对黄酮得率的影响

提取时间对黄酮得率的影响如图2所示。

图2 提取时间对黄酮得率的影响

从图2可知，当提取时间为40 min时，黄酮得率最大，之后有所下降。其原因在于提取的前期，细胞内黄酮快速扩散到溶剂中，使得其得率显著增加；大于40 min后，由于长时间的超声波机械效应和热能效应对黄酮结构产生破坏，同时又造成细胞内其它杂质扩散进入溶剂中，使得黄酮得率下降。试验结果说明提取时间选40 min为宜。

2.1.3 料液比（g：mL）对黄酮得率的影响

料液比对黄酮得率的影响如图3所示。

图3 料液比对黄酮得率的影响

从图3可知，随着料液比的提升，黄酮得率逐渐增大，当料液比大于1∶25之后，黄酮得率增速放缓。其主要原因是当料液比大于1∶25后，细胞内黄酮大部分已经溶出，其次，随着提取液所占比例的进一步增加，超声波功率较多地消耗在溶剂中，细胞所吸收的能量相对减少，故提取率不再急剧增加。为节约提取成本，料液比选1∶25为宜。

2.1.4 超声功率对黄酮得率的影响

超声功率对黄酮得率的影响如图4所示。

图4 超声功率对对黄酮得率得率的影响

从图4可知，超声功率为250 W时，黄酮得率最大。其原因是一开始随着超声功率的增加，对细胞的破坏作用逐渐增强，这促进了黄酮的溶出，使其率逐渐增加，但当提取功率大于250 W时，引起局部高温，会破坏黄酮的结构，使得其得率下降。试验结果说明超声功率选250 W为宜。

2．2 响应面法优化薏苡仁黄酮提取工艺参数

2.2.1 响应面试验设计及结果

以单因素试验结果为基础，根据Box－Behnken试验设计原理，设计四因素三水平为响应面（表1）来优化因素，以黄酮得率为响应值做分析，试验数据见表2。

应用Design Expert 8.05软件对表2中数据进行多元回归分析，得到薏苡仁黄酮得率（Y）对乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、料液比（C）、超声功率（D）的二次多项式回归方程：

2.2.2 回归方差分析

对回归方程式（3）进行方差分析，结果见表3。从表3可知，该模型的P＜0.0001，表明差异极显著；失拟项P＝0.9178＞0.05，表明不显著；相关系数R2＝0.9583，调整系数R2Adj＝0.9166，说明拟合情况良好，能真实反映各影响因子与响应值之间的关系，能较好地对响应值进行分析与预测。

2.2.3 响应面图及其等高线分析结果

根据二次多项式回归方程得出不同因子的响应面和等高线图，在响应面图中曲面越陡峭，则表明两因素的交互作用越显著；等高线接近圆形，表明两因素间的交互作用较弱，接近椭圆形，表明两因素间的交互效应较强。两因素交互作用对黄酮得率影响的响应面及等高线如图5所示。

表2 中心组合试验方案及结果

图5（a）表示乙醇浓度和超声时间的交互作用对黄酮得率的影响。从图5（a）可知，其等高线呈椭圆形，表示两因素的交互作用显著；在试验水平范围内，随着乙醇浓度的增加黄酮得率呈先增加后减小的趋势；在乙醇浓度较低时超声时间对黄酮得率的影响显著，随着超声时间的增加黄酮得率先增加后减小；在乙醇浓度较高时，超声时间对黄酮得率的影响不大。

图5 两因素交互作用对黄酮得率影响的响应面及等高线

图5（b）表示乙醇浓度和料液比对黄酮得率的影响。从图5（b）可知，乙醇浓度在80%～85%、料液比在1∶20～1∶25范围内时，乙醇浓度和料液比两因素存在显著地增效作用，黄酮得率随着两者的增大而增加。而在乙醇浓度为85%～90%、料液比在1∶25～1∶30范围内时，黄酮得率随着两者的增加而降低。图5（c）表示料液比和超声时间对黄酮得率的影响。从图5（c）可知，其响应面陡峭，等高线呈椭圆，说明料液比和超声时间对黄酮得率的交互作用影响显著。

应用Design Expert 8.05软件求解回归方程，得到薏苡仁黄酮提取工艺的最佳参数为：料液比1∶23.85、乙醇浓度86.15%、超声功率242.5 W、超声时间39.98 min，在此条件下黄酮得率为0.57%。考虑到实际操作的可行性，将薏苡仁总黄酮的提取工艺参数修正为：料液比1∶25、乙醇浓度85%、超声功率250 W、超声时间40 min。为了验证结果的可靠性，采用修正参数做3次平行试验，测得黄酮得率为0.53%，与预测值0.57%基本吻合，说明应用Design Expert 8.05软件得到的黄酮提取工艺参数是真实可靠的，具有实际应用价值。

表3 回归方程的方差分析

2．3 薏苡仁总黄酮抗氧化活性分析

2.3.1 薏苡仁总黄酮还原能力的测定

抗氧化剂的抗氧化能力与其还原力有关，还原力越大，抗氧化能力越强［15］。薏苡仁总黄酮为抗氧化物质，能使Fe3＋还原成Fe2＋，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，从而可以通过比色测出其抗氧化能力的强弱［16］。薏苡仁总黄酮的还原能力随质量浓度的变化如图6所示。

图6 薏苡仁总黄酮的还原能力随质量浓度的变化

从图6可知，在一定质量浓度范围内，薏苡仁总黄酮抗氧化能力随其质量浓度的增加而增加，两者呈现出良好的量效关系；另一方面，当薏苡仁总黄酮和Vc的质量浓度都接近0.1 mg／mL时，两者的还原能力几乎相当，但随着质量浓度的增加，二者之间出现差异，薏苡仁总黄酮抗氧化能力明显低于Vc。

2.3.1 薏清除DPPH自由基能力

DPPH法是评价抗原化活性的常用方法，抗氧化物质可直接作用于DPPH自由基使其颜色变浅，再用分光光度计来测定物质的抗氧化活性［17］。薏苡仁总黄酮对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的变化如图7所示。

从图7可知，随着薏苡仁总黄酮、Vc质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率均呈上升趋势，两者质量浓度与DPPH自由基清除率之间均表现出良好的量效关系，当总黄酮、Vc的浓度为12 mg／mL时，两者的自由基清除率分别为91.1%、96.2%。此外，总的来说薏苡仁总黄酮的DPPH自由基的清除能力低于Vc。

图7 薏苡仁总黄酮对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的变化

3 结论

在单因素的试验基础上，选取乙醇浓度、超声时间、料液比、超声功率为影响因素，根据Box－Benhnken中心组合进行四因素三水平的试验设计，以黄酮得率为响应值进行响应面分析，优化了薏苡仁总黄酮的超声波辅助乙醇提取工艺。优化的提取工艺为：乙醇体积分数85%、超声时间40 min、料液比1∶25（g：mL）、超声功率250 W，在此条件下，薏苡仁总黄酮的提取得率为0.53%，模型的预测值为0.57%，两者基本吻合，表明所建的数学模型与实际情况拟合度较好，也说明优化的工艺参数可靠、稳定，为薏苡仁总黄酮的提取工艺提供了科学的理论依据。研究发现在一定质量浓度范围内，薏苡仁总黄酮抗氧化能力和DPPH自由基清除率随其质量浓度的增加而增加，两者都与质量浓度呈现出良好的量效关系，当浓度为12 mg／mL时，自由基清除率为91.1%。