类风湿关节炎中医证型与IL-17及其相关炎症因子表达的研究

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1.贵阳中医学院第二附属医院，贵州 贵阳 550003； 2.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵犯关节及关节周围软组织为主要特征的全身性自身免疫病。RA在全球的患病率为0.5%～1.0%，是临床常见的难治性疾病，严重影响着患者的生活质量[1-2]。目前RA发病机制仍不清楚，近来研究发现RA的发病与体内白介素17(interleukin 17，IL-17)的表达有关[3-4]。IL-17是近年来新发现的一个白介素家族成员，其参与了RA的发病及病情进展，主要由Th17细胞分泌而产生，具有强大的致炎作用，在RA的发病及病情进展过程中发挥重要作用，成为近年来研究的一个热点[5-7]。IL-17具有很强的促炎作用，能诱导IL-6、IL-22、IL-23等炎症因子的产生，加强炎症的表达，而这些炎症因子反过来又能进一步促进Th17的活化[8]。Th1细胞主要产生干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)等细胞因子，可以抑制Th17细胞，从而起到抗炎的作用；但IFN-γ的促炎效应及抑炎效应均有报道，故其属于促炎因子还是抗炎因子仍存在一定的争议[9]。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)主要产生IL-4、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等抗炎因子，在调节免疫紊乱，维持免疫耐受等方面发挥作用[10-11]。

RA属中医“痹证”、“历节”、“尪痹”、“白虎病”等范畴。有研究发现不同中医证型的RA患者，其在年龄、病程、地域、实验室检验及检查等方面存在差异[12-13]，但RA患者IL-17及其相关炎症因子与中医证型之间关系的研究却寥寥无几。因此，本研究通过检测RA不同中医证型患者血清中IL-17及其相关炎症因子表达水平，探讨IL-17及其相关炎症因子与RA中医证型之间的内在联系，以期为RA的临床辨证分型及治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 健康对照组来源于贵阳中医学院第二附属医院体检中心,已排除高血压、糖尿病等长期慢性疾病，且实验室检测各项指标均在正常范围的健康志愿者外周血标本30例，其中男性11例、女性19例，年龄18～60岁，平均年龄(46.25±14.55)岁。选取2017年6月至12月在贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科住院RA患者120例，其中男性9例、女性111例，年龄21～70岁，平均年龄(52.32±10.17)岁，病程1个月至26年，平均病程(59.73±11.28)月。

1.2 诊断标准 120例RA患者均符合2010年ACR/EULAR中对RA的诊断标准[14]，并根据《中药新药临床研究指导原则(试行)》[15]将RA患者分为湿热痹阻、寒湿痹阻、痰瘀痹阻、肝肾亏虚4个证型各30例。

1.3 纳入标准 符合RA西医诊断标准和中医诊断标准；年龄在18～70岁的患者；未伴有其它影响治疗和检测指标的疾病；近3个月未应用非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素及免疫抑制剂治疗；愿接受检测治疗者，并签订知情同意书。

1.4 排除标准 不符合纳入标准者；严重心脑肝肾功能不全及伴随其它恶性肿瘤者；患者不能合作者。

1.5 实验试剂 PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD3(美国BD公司，批号：5320730)；PharmingenTMPerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8(美国BD公司，批号：7096834)；PharmingenTMLeukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlugTM(美国BD公司，批号：7030717)；PharmingenTMAlexa Fluor® 647 Mouse anti-Human IL-17A(美国BD公司，批号：7132681)；Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO(美国BD公司，批号：6292704)；人白介素4(IL-4)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N26015213)；人白介素6(IL-6)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N26011217)；人白介素17(IL-17)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N26015431)；人白介素22(IL-22)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N27147789)；人白介素23(IL-23)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N28015215)；人干扰素γ(IFN-γ)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N26011127)；人转化生长因子β(TGF-β)酶联免疫ELISA试剂盒96T(武汉华美生物科技有限公司，批号：N24015112)。

1.6 实验仪器 台式低速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司，TDL8M)；BD FACSCantoTM II型流式细胞仪(美国BD公司，V33947300248)；电热恒温水浴箱[北京医疗设备厂，(S)HHW21]；无菌流式管(贵州泰思腾生物科技有限公司，922746)；CO2培养箱(上海华连医疗器械公司，DH25000)；酶标分析仪(深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司，YZB/粤0198-2012)；洗板机(深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司，KWP-100A)。

1.7 外周血淋巴细胞(PBMC)中IL-17表达检测 采用流式细胞术检测。取2 mL新鲜抗凝血与PBS液2 mL混匀，加入4 mL人淋巴分离液中，2000 r离心20 min，吸取乳白色单核细胞层即为PBMC，加入1 mLPBS液洗涤1次，配置250 μLPBMC；加入250 μL RPMI 1640细胞培养液，加入250xBD PharmingenTMLeukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlugTM(刺激阻断剂)2 μL，震荡混匀，放入37℃ 5%CO2培养箱4～6 h；加入20 μL BD PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD3及5 μL BD PharmingenTMPerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8，混匀，室温避光30 min；加入Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO(破膜剂)1 mL，室温避光30 min；加入PBS液1 mL，1500 r离心5 min，弃上清；加入PBS液1 mL，将细胞悬液分为两份，分别加入20 μL BD PharmingenTMAlexa Fluor® 647 Mouse anti-Human IL-17A及Alexa Fluor® 647 Mouse IgG1 K Isotype control，4℃避光孵育30 min；再加入1 mL流式染色缓冲液洗涤1次，1500 r离心5 min，弃上清；加入PBS液500 μL重悬后上机检测，用流式细胞仪分析外周血CD3+CD8-IL-17+表达的百分率。

1.8 血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的水平检测 采用ELISA法检测。RA患者及健康对照组清晨空腹抽取外周静脉血，离心后取血清，按照ELISA试剂盒说明书上的步骤检测血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的浓度。

2 结果

2.1 中医证型与性别、年龄、病程的关系 结果显示：不同中医证型间在性别、年龄及病程上相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 中医证型与性别、年龄、病程的关系

2.2 流式细胞仪检测各组间CD3+CD8-IL-17+表达水平比较 与健康对照组比较，RA患者各组CD3+CD8-IL-17+表达水平均明显升高。各组间相互比较均有统计学差异(P<0.05)。IL-17细胞的表达率由高到低依次为湿热痹阻组、寒湿痹阻组、痰瘀痹阻组、肝肾亏虚组、健康对照组，见图1～8、表2。

中医证型例数CD3+CD8-IL-17+/%健康对照组300.12±0.03寒湿痹阻组305.53±0.78∗湿热痹阻组308.78±1.14∗●肝肾亏虚组301.57±0.44∗●■痰瘀痹阻组302.79±0.67∗●■▲

注：与健康对照组相比，*P<0.05；与寒湿痹阻组相比，●P<0.05；与湿热痹阻组相比，■P<0.05；与肝肾亏虚组相比，▲P<0.05。

2.3 ELISA法检测各组间IL-4、TGF-β1的表达情况 与健康对照组相比，RA患者各组IL-4、TGF-β1表达水平均明显下降(P<0.05)；肝肾亏虚组、痰瘀痹阻组IL-4、TGF-β1水平明显高于寒湿痹阻组、湿热痹阻组，有统计学差异(P<0.05)；寒湿痹阻组、湿热痹阻组相比无统计学差异(P>0.05)；肝肾亏虚组、痰瘀痹阻组比较亦无统计学差异(P>0.05)；IL-4、TGF-β1检测结果由高到低排列为健康对照组>肝肾亏虚组>痰瘀痹阻组>寒湿痹阻组>湿热痹阻组。见表3。

表3 不同证型组间IL-4、TGF-β1的表达水平比较

注：与健康对照组相比，aP<0.05；与寒湿痹阻组相比，bP<0.05；与湿热痹阻组相比，cP<0.05。

2.4 ELISA法检测各组间IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的表达情况 与健康对照组相比，寒湿痹阻组、湿热痹阻组、肝肾亏虚组、痰瘀痹阻组IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ水平均有统计学差异(P<0.05)；湿热痹阻组、寒湿痹阻组IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ水平明显高于肝肾亏虚组、痰瘀痹阻组，有显著性差异(P<0.05)；湿热痹阻组、寒湿痹阻组相比无统计学差异(P>0.05)；肝肾亏虚组、痰瘀痹阻组比较亦无统计学差异(P>0.05)；IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ检测结果由高到低排列为湿热痹阻组>寒湿痹阻组>痰瘀痹阻组>肝肾亏虚组>健康对照组。见表4。

表4 不同证型与IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的关系

续表4

表4 不同证型与IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的关系

注：与健康对照组相比，dP<0.05；与肝肾亏虚组相比，eP<0.05；与痰瘀痹阻组相比，fP<0.05。

3 讨论

西医认为RA可由多种免疫细胞及其分泌的细胞因子共同参与引起慢性炎症病变，其病理特征是慢性炎症细胞浸润，滑膜增厚、血管新生等，最终导致关节畸形，功能丧失[16]。RA属中医“痹证”、“历节”、“尪痹”、“白虎病”、“骨痹”、“鹤膝风”等范畴，主要临床表现以肢体关节、肌肉疼痛、肿胀、酸楚、麻木、重着、变形、僵直、畸形及活动受限等症状为特征[17]。临床实践证明中医药辨证治疗RA疗效显著，但中医辨证分型缺乏客观依据，且各医家见解不同，辨证思路亦有差别，所以遣方用药及疗效评价差异较大，RA的中医辨证评判标准并未统一，影响到临床的进一步推广。基于以上认识，实现中医现代化，寻找与RA辨证论治相对应且具有可重复性的客观医学指标具有重要意义，既要遵循中医理论，又能适应现代医学的发展规律，才能更好地为患者服务。

本次实验中对120例RA患者的研究发现IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ均在RA各证型间存在显著差异，且明显高于正常对照组，其在血清中的浓度由高到低依次为：湿热痹阻组、寒湿痹阻组、痰瘀痹阻组、肝肾亏虚组、健康对照组，4种证型中湿热痹阻型RA患者IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ的表达水平升高最显著，提示湿热痹阻型RA患者可能更多处于病情活动期，其自身免疫处于活跃状态；从中医上讲，可能因外感湿热之邪蕴结于内，或嗜食肥甘厚腻，脾为湿困，郁而化热，湿热壅盛，正邪交争剧烈有关。本研究还发现，湿热痹阻型、寒湿痹阻型RA患者IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ表达水平明显高于肝肾亏虚型与痰瘀痹阻型，后两型虽有升高，但表达远不如前两者显著。RA患者血清中可出现IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ表达升高，与国内外研究报道相吻合，说明其这些炎症因子共同参与了类风湿关节炎的发生发展。本研究结果与大多数研究相同，RA患者IFN-γ水平较正常组明显升高，表明IFN-γ可能在RA中作为促炎因子而发挥作用。

IL-4、TGF-β1在RA各证型间存在统计学差异，且明显高于正常对照组，其在血清中的浓度由高到低排列依次为肝肾亏虚组、痰瘀痹阻组、寒湿痹阻组、湿热痹阻组；说明这两个细胞因子共同抑制了RA炎症的进一步发展。在国内外研究中发现：IL-4到底是抑制炎症的表达还是促进炎症的表达仍存在争议[18-20]，本研究结果与大多数研究结果相一致：IL-4抑制了RA炎症的表达，但限于本次实验中样本数量有限，未来有待大样本实验进一步进行论证。本次研究结果显示：无论是活动期RA患者还是非活动期RA患者，其血清中TGF-β1的表达水平均显著低于正常对照组，且活动期RA患者比非活动期RA患者血清中TGF-β1的表达量要更低，这与Valle等[21]的研究结果相一致。这说明TGF-β1在RA的病程中主要发挥免疫抑制作用，其表达量水平下降可引起RA患者调节免疫的活性下降。

本研究以炎症细胞因子为切入点，通过ELISA和流式细胞术检测不同中医证型RA患者血清中IL-4、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TGF-β1的表达水平及IL-17在淋巴细胞中所占的比例，探讨IL-17及相关炎症因子与RA中医证型之间的关系，未来可将更多的炎症因子参与到RA不同中医证型的研究中来，更好地为中医辨证分型及治疗提供依据和借鉴。