扁果枸杞肌动蛋白基因片段的克隆及其表达特征分析

袁惠君，李学勇，高泽，王春梅，李虎军

1(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州，730050) 2(中国农业科学院,兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州，730050) 3(兰州大学 草地农业科技学院,草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州，730020)

扁果枸杞(LyciumbarbarumBianguo)是宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的一个品种，其干燥果实具有极高的营养价值，枸杞多糖和还原型VC含量分别达11.18 mg/100 g和1 234.64 mg/100 g，远高于宁杞1号、宁杞7号、宁杞0901等常规栽培品种[1-3]。同时，扁果枸杞还具有极强的抗旱耐盐特性，在渗透胁迫下能通过体内积累适量的Na+，调控体内渗透平衡，改善细胞水分状况，维持其正常的生长[4]，是研究植物抗逆机理和挖掘抗逆基因资源用于作物遗传育种的研究材料。

肌动蛋白(actin)ACT基因是真核生物细胞中一种普遍存在的组成型表达的看家基因，编码的肌动蛋白是细胞骨架中微丝的主要组分，参与细胞分裂、内吞、信号传导、顶端生长、细胞器运动等多种生命活动[5]。ACT基因表达量高且稳定，序列高度保守[6]，是用于基因表达分析的理想内参基因[7-9]，但有关扁果枸杞ACT基因克隆未见报道。本研究用RT-PCR法克隆扁果枸杞ACT基因核心片段，并进行一系列序列分析，为深入研究宁夏枸杞功能基因和果实品质改良奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

扁果枸杞种子于2013年7月采自白银市景泰县玉杰农贸有限公司枸杞引种示范基地，以3周龄幼苗为实验材料。

pUC18-T载体、UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、T-载体PCR产物克隆试剂盒、4S Red Plus Nucleic Acid Strain、6×Loading Buffer、X-gal、IPTG、Amp、V(氯仿)∶V(异戊醇) =24∶1、无水乙醇等，均购自上海生工生物工程有限公司。大肠杆菌菌株DH5α、PrimeScriptTMⅡ第一链cDNA合成试剂盒和PCR扩增试剂盒，均购自大连TAKARA生物工程有限公司。DNA marker，购自北京天根生化科技有限公司。琼脂糖，购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯，样品测序由华大基因完成。

1.2 仪器与设备

DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；Genesy 96T型PCR扩增仪，西安天隆科技有限公司；5424R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Nichipet ExⅡ型移液枪，日本立洋公司；7500 Real-Time PCR System，Life Technologies Holdings Pte Ltd.；HH-S6型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料培养

参考文献方法[4]，挑选籽粒饱满的种子用体积分数2%次氯酸钠消毒后，铺在有湿润滤纸的平皿里，待种子萌发后种于蛭石中，浇灌1/2 Hoagland营养液，每3 d换1次营养液，温室的昼夜温度分别为(24±2) ℃，(18±2) ℃，光照时间16 h/d，光照强度约600 μmol/(m2·s)，相对湿度约为50%。挑选生长健壮的3周龄幼苗用于实验。

1.3.2 总RNA的提取和cDNA的合成

取3周龄幼苗的根、茎和叶80～100 mg，置于液氮中速冻并研磨后，按照RNA抽提试剂盒说明提取总RNA。将提取到的总RNA在使用和保存之前取2 μL 用核酸定量仪检测总RNA纯度和浓度，取A260/A280的值在1.8～2.0的RNA样本根据测定出的RNA浓度计算下一步合成cDNA所需模板的用量。cDNA第一链合成按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 引物设计与合成

从NCBI数据库下载番茄、马铃薯、烟草等茄科植物已知ACT基因的序列，进行同源性比较后筛选高度保守的区段，利用DNAMAN 6.0和Primer 5.0生物软件设计一对引物P1、P2。用该引物扩增扁果枸杞ACT基因片段，预测所得片段长度为598bp。引物由上海生工合成。P1：5’- GTGGTCGTACAACAGGTATTGTG -3’；P2：5’- GAACCTCCAATCCAGACACTG -3’。

1.3.4 RT-PCR扩增

以扁果枸杞叶反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，25 μL反应体系包含2 μL cDNA、引物P1、P2各1 μL、0.5 μL dNTP(10 mmol/L)、2.5 μL缓冲液、0.2 μLTaq酶，加17.8 μL ddH2O补足体系。PCR扩增程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。 PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后切下目的条带，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收片段。根据T-载体PCR产物克隆试剂盒说明，将回收片段重组入pMD18-T载体，再用热激法将连接产物转化DH5α感受态细胞，并接种到含有X-gal、IPTG、Amp的Luria-Bertanil(LB)固体培养基上，37 ℃ 培养过夜，随机挑取白色菌斑接入1 mL含有100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养8～12 h后离心并收集菌体，用菌液PCR的方法筛选出阳性克隆，送至华大基因北京测序部进一步测序鉴定。

1.3.5 序列分析

从NCBI数据库下载其他植物ACT蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN生物分析软件进行多重比对，并用MEGA 5.1 软件进行系统发育分析和进化树构建，用Neighbor joining法构建进化树，自展次数为1 000 次。

1.3.6 盐处理下LbACT表达特性分析

盐处理如下，用含有0(对照)、50、100、150、200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland营养液处理3周龄扁果枸杞幼苗24 h后，分别取根、茎、叶提取总RNA。每个处理3个重复，每个重复包括2～3株幼苗。

根据已经得到的LbACT基因片段的序列设计LbACT实时定量引物QA1：5’-CTATGAGTTGCCAGATGGACAG-3’；QA2：5’-TGGCTGGAAAAGGACTTCTG-3’。参照TAKARAPrimeScriptTMeRT reagent Kit with gDNA Eraser (perfect real time)反转录试剂盒说明书，合成第一链cDNA，并根据SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书以第一链cDNA为模板，建立20 μL实时定量PCR反应体系：10.0 μL的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)、引物QA1和QA2各0.8 μL、0.4 μL 的ROX Reference Dye(50×)、2.0 μL的cDNA模板及6.0 μL灭菌水。由7500 Real-Time PCR系统进行PCR反应后，用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2013软件对仪器自动得出各样品Ct值进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取及检测

以扁果枸杞根、茎和叶为材料提取的总RNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，28S rRNA和18S rRNA条带清晰(图1)，前者亮度约是后者的2倍，说明提取的RNA完整性较好，可用于RT-PCR扩增。

图1 扁果枸杞根、茎和叶总RNA提取Fig.1 Electrophoresis of total RNA fromroot, stem and leaf in L. barbarum Bianguo

2.2 RT-PCR扩增及阳性克隆的鉴定

以扁果枸杞叶总RNA反转录所得到的第一链cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，得到的产物经琼脂糖凝胶电泳(图2)，在500 bp～750 bp有一条亮带，且上下无杂带，与预测的目的片段大小一致，表明该条带可能是目的基因片段，有待进一步测序鉴定。

M-DNA Marker; 1-PCR扩增产物图2 扁果枸杞LbACT基因片段的PCR产物凝胶电泳Fig.2 Electrophoresis of the fragments of LbACT gene by PCR

目的片段经回收、连接到pMD18-T克隆载体，并转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取8个菌斑培养后，用菌液PCR的方法扩增目的片段，并经琼脂糖凝胶电泳检测，选择在500～750 bp出现一条亮带(图3)，与预测目的片段大小一致的菌斑初步确定为阳性克隆。

M-DNA Marker;1～4-PCR扩增产物图3 扁果枸杞LbACT基因片段PCR产物阳性克隆凝胶电泳Fig.3 Electrophoresis of positive clones of LbACT gene by PCR

2.3 序列分析

随机挑取阳性克隆培养后进行测序和分析，得到一段长度为598 bp的序列，编码198个氨基酸(图4)。

图4 扁果枸杞LbACT基因片段的核苷酸序列及其推测的氨基酸序列Fig.4 Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of actin gene fragment fromleaf in L. barbarum Bianguo

Blast比对结果表明，该片段与其他100种植物ACT基因核苷酸序列的相似性在87%～97%，其中与枸杞(Lyciumchinense)核苷酸序列的同源性达到100%。将预测的扁果枸杞氨基酸序列片段和其他11种植物肌动蛋白基因的氨基酸序列进行多重比较，发现其保守氨基酸多达167个，而非保守氨基酸仅有31个(图5)。

图5 扁果枸杞LbACT氨基酸序列与其他植物Actin氨基酸序列多重比较Fig.5 Multiple comparison in amino acid sequence of actin between leaves of L. barbarum Bianguo and other plants

图6 Neighbor joining法构建LbACT氨基酸序列进化树Fig.6 Phylogenetic tree of Actin amino acid sequence of LbACT by Neighbor joining method

Neighbor joining法构建进化树也表明，该氨基酸序列与枸杞LcACT同源性达95%，但与其他植物进化较远(图6)。这些结果表明克隆的基因片段为扁果枸杞肌动蛋白基因片段，命名为LbACT。根据其核苷酸序列预测的氨基酸序列是扁果枸杞肌动蛋白的高度保守区域。

通过BlastP对LbACT基因编码的蛋白进行保守区预测表明，LbACT属于NBD sugarkinase HSP70 actin superfamily家族(图7)。

2.4 盐处理下LbACT基因的表达特征分析

如图8所示，不同浓度NaCl处理24 h后，在0、100和150 mmol/L NaCl处理时叶、茎、根的LbACT的Ct平均值差异不显著；在50 mmol/L NaCl处理时，根的Ct值高于茎和叶，在200 mmol/L NaCl处理时，茎的Ct值低于根；频数分布特征为，Ct平均值是19.85，变异系数为2.22，峰度系数为1.68，属于尖峰分布，表明整体Ct值集中，波动范围小。

图7 扁果枸杞LbACT保守区结构域预测Fig.7 Conserved domains of LbACT protein from L. barbarum Bianguo

图8 qRT-PCR分析扁果枸杞LbACT的表达特征Fig.8 Expression characters of LbACT gene by qRT-PCR analysis注：不同小写字母表示不同器官各NaCl处理间的差异显著性(P<0.05)。

相关性分析表明，在叶和茎中，不同浓度NaCl处理0、12、24、72 h下，Ct值与NaCl浓度无关；在根中，仅在不同浓度NaCl处理12 h时影响Ct值(表1)。上述结果均表明，盐处理下LbACT基因在各器官中的Ct值稳定。

表1 扁果枸杞LbACT的Ct值与不同浓度NaCl处理的相关性分析Table 1 Correlation analysis betweenthe Ct value of LbACT and the concentration of NaCl treatments

注：“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01)。

3 讨论

高等真核生物肌动蛋白参与多种重要的生命活动，其基因也是由肌动蛋白多基因家族编码，因而形成了多种肌动蛋白异型体[10]，已知茄科植物中的马铃薯至少有5个编码肌动蛋白的基因[11],茄有10个[12]。植物肌动蛋白异型体的表达虽然具有组织和器官特异性,但在一级结构上有很高的同源性[13-15]，具备作为内参基因的良好条件。宁夏枸杞根、叶、果实均可入药或食用[16-18]，是甘肃、宁夏、内蒙古、青海等西北半干旱地区重要的经济植物[16,19]。但是，不同地区、品种的宁夏枸杞在抗逆性、营养成分含量上存在显著差异[4,16,20]，目前对其分子机理知之甚少，克隆内参基因并验证其表达稳定性是分析基因表达丰度和模式，进一步解析植物基因功能、探索植物复杂代谢网络必不可少的工作。本文克隆了宁夏枸杞一个抗逆品种——扁果枸杞的肌动蛋白基因片段，该片段长598 bp，满足半定量PCR和实时荧光定量PCR分析基因表达的引物设计需要；同时，其核苷酸序列与其他植物的相似度达87%～97%，具有极高的保守性；不同浓度盐处理下，LbACT基因在各器官中的Ct值稳定。这些特征都表明，LbACT基因是研究扁果枸杞功能基因的表达模式分析的良好内参基因，将为进一步开展宁夏枸杞代谢网络研究和品质改良奠定基础。