用13C脉冲标记法研究互花米草光合碳的分配

冉珊珊 ，时宇 ，黄黄 ，陈为祥 ，刘金娥 *，苏海蓉，徐杰

1. 南京师范大学环境学院/江苏省地理信息资源开发与利用协同创新中心，江苏 南京 210023；2. 江苏省水土环境生态修复工程实验室，江苏 南京 210023

互花米草（Spartina alterniflora）是多年生C4草本植物，原产于美国大西洋沿岸，1979年引入中国沿海并迅速扩展。中国海岸带互花米草植被的覆盖面积已达到34451 hm2，其中以江苏海滨湿地的现有面积最大，达18711 hm2（左平等，2009）。光合碳是“大气-植物-土壤”系统碳循环的重要组成部分，与大气环境、土壤质量变化关系密切（周广胜等，2003；尹云锋等，2010）。植物光合作用是陆地和大气间碳循环的驱动力，是土壤有机碳的重要来源。互花米草迅速扩张使江苏盐城湿地土著种面积不断减小，对盐沼土壤碳的输入输出及循环产生显著影响，因此研究互花米草生长光合碳的分配与固定，对湿地碳平衡具有重要意义。

稳定同位素示踪技术是研究光合碳固定、分配及转移的重要手段，具有安全、稳定、易操作等优点，目前被广泛应用在生物地球化学过程的研究中（冯建祥等，2013），国内用13C脉冲法研究植物光合碳的分配主要集中在玉米（何敏毅等，2008）、水稻和小麦（齐鑫等，2008）等作物，但关于互花米草光合碳的分配鲜有研究。本研究利用13C脉冲标记法示踪互花米草光合碳在互花米草-土壤系统中的分配和去向，为科学评价外来入侵物种互花米草光合碳的分配提供参考，为研究互花米草对湿地碳源与汇的影响提供依据。

1 研究材料与方法

1.1 互花米草室内栽培

于2015年4月采集盐城湿地表层0－20 cm土壤以及互花米草幼苗植株，将互花米草幼苗植株移栽至PVC管（直径10 cm，高35 cm）中，2015年4－9月进行室内培养。土壤有机碳7.00 g·kg-1，全氮 1.70 g·kg-1，总磷 0.31 g·kg-1，每盆装风干土约5 kg，种植互花米草1株，共种植30盆，其中15盆互花米草用13C脉冲标记，另外15盆不做标记处理。

1.2 互花米草13C脉冲标记

标记处理在特制的有机玻璃箱（长×宽×高 1.5 m×0.9 m×1.2 m）内进行，每隔30 d向玻璃箱中通入NaH13CO3与 HCl溶液反应产生的13CO2气体（NaH13CO3+HCl=NaCl+H2O+13CO2，99 atom%13C），每次NaH13CO3的用量为10 g，共进行4次标记。标记一般在8:00－12:00且晴朗的天气进行，在标记过程中，箱内温度控制在28.5－37.6 ℃之间，加入适量冰块防止箱内温度过高。在箱内顶部安装两个小型风扇保证箱内气体混合均匀。标记步骤：（1）标记前将栽植互花米草的 PVC盆放入标记箱的底座上，在底座里加入适量冰块，并放置4个250 mL烧杯，其中两个放置NaH13CO3各5 g，另外两个放置NaH12CO3各5 g；（2）将有机玻璃箱放在底座槽内，向底座槽内注满自来水密封，开启风扇让互花米草先光合作用15 min（也有研究者用碱液吸收法将空气中CO2吸收掉），使互花米草处于饥饿状态，提高互花米草13CO2的吸收；（3）标记时先用黑布遮住有机玻璃箱，用医用塑料滴管迅速向装有NaH13CO3的烧杯中注入250 mL 2 mol·L-1的HCl溶液，待反应5 min后，将黑布移开，让互花米草在有机玻璃箱内进行光合作用；（4）待标记45 min后，重复步骤（3）继续向装有NaH13CO3的另一个烧杯中注入HCl溶液使其产生13CO2气体，最后2次，向装有NaH12CO3的烧杯注入HCl溶液使其产生12CO2，以达到较好的标记效果。在2015年6－9月每月对互花米草进行1次脉冲标记实验，共进行4次。

1.3 样品采集与分析

在每次标记后的第10天随机选择未标记（CK）和标记（BJ）的互花米草各3盆，进行破坏性取样，收获互花米草的叶、茎、根、根际土壤以及 PVC管中土体。互花米草用蒸馏水洗净后，放入烘箱内于60 ℃下烘干至恒重，磨碎备用。根际土壤以及土体挑出贝壳、植物根系后自然风干，磨碎，过孔径0.150 mm筛备用。

互花米草根、茎、叶、根际土壤以及土体的全碳含量、13C自然丰度用同位素质谱仪（Sercon intergra CN）测定。

1.4 指标计算方法

（1）土壤或植物的13C自然丰度用δ13C值表示，公式如下（刘萍等，2015）：

式中，Rsample是样品13C值和12C值的比值；RPDB是标准物质13C值和12C值的比值，是一个定值，为0.0112372。

标记过土壤或植物一般用同位素丰度F（%）表示，δ13C与F可以相互转换，转换公式如下（Lu et al.，2003；齐鑫等，2008）：

（2）互花米草各组分固定13C量计算公式如下（安婷婷等，2013）：

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式中，mCi为各组分碳量；Fm为标记互花米草组分13C丰度；Fum为未标记互花米草组分13C丰度。

各组分13C分配比例P13Ci（%）（安婷婷等，2013）：

式中，m13Ci,ft为互花米草根、茎、叶、根际土壤以及土体固定13C量的总和。

标记效率Em（13C固定百分比）：

1.5 统计分析

运用Excel进行数据整理，SPSS软件进行统计分析，ArcGIS 9.3和OriginPro 8.5绘图。

2 结果与分析

2.1 互花米草不同器官13C丰度的动态变化

未标记（CK）互花米草根、茎、叶、根际土壤以及土体的13C丰度在4次标记后差异不显著，其中根、茎、叶13C丰度在1.1443%－1.1573%之间，根际土壤以及土体的13C丰度在 1.1121%－1.1125%之间（图1a）。未标记的互花米草13C丰度呈现由地上部分向地下部分递减的规律，其中土体13C丰度波动较小，比较稳定。在4次同位素脉冲标记后，与未标记组相比，标记后（BJ）互花米草各组分以及土壤的13C丰度值都呈现明显上升趋势（图1b），但根际土壤、土体相对植物根、茎、叶变化不明显，较稳定。互花米草在经过第4次标记后的第10天收获，收获后测定的互花米草根、茎、叶 δ13C 值分别为 397.23‰、721.77‰、606.07‰、69.4‰和29.4‰，根际土壤δ13C值也高达29.4‰，明显发生了富集。

图1 互花米草-土壤系统13C丰度值Fig. 1 Abundance value(F) of 13C in S. alterniflora-soil system

2.2 净光合13C在植物-土壤中的分配

2.2.1 互花米草-土壤系统中各组分固定13C量

在每次标记结束后取样，测定叶、茎、根和土壤中的13C含量，计算其固定13C量以及在各部分的分配比例。4次标记各器官总共固定的13C量分别为 52.80、125.20、217.11和 276.81 mg·plant-1（以C计）。4次标记后，互花米草各个器官（叶、茎、根）、根际土壤以及土体固定的13C量随标记次数增加而逐渐增加，固定13C量呈现茎、叶、根、根际土壤、土体逐渐减小的趋势（表1）。互花米草-土壤体系中，各组分固定的碳量随着标记次数增加而逐渐增加，但互花米草固定的13C主要集中在地上部分（茎、叶）。土体中碳含量逐渐增加，表明在供试土壤条件下，互花米草生长促进了土壤碳汇的作用。

2.2.213C在互花米草各部位及土壤中的分配比列

各组分固定13C占净光合13C的比例称为该组分13C的分配比例。4次标记后，叶、茎、根、根际土壤以及土体各组分固定13C量占净光合13C总量分配比例按茎、叶、根、根际土壤、土体依序逐渐减少（图2）。互花米草叶固定13C量分配比例在32.48%－39.20%之间；茎固定13C量分配比例在39.83%－47.65%之间；根固定13C量分配比例在18.01%－20.34%之间；根际土壤固定13C量分配比例较稳定，波动较小，随标记次数增加呈先增加后下降再上升的规律，分配比例在 0.30%－0.42%之间；土体固定的13C量占净光合碳的比重较小，随标记次数增加呈现上升的趋势，分配比例在0.08%－0.20%之间。光合作用固定13C在地上部分（茎、叶）的分配比例在 75.36%－81.13%之间，地下部分（根、根际土壤、土体）的分配比例在 18.51%－24.63%之间。地上部分固定的13C显著高于地下部分。

图2 13C在互花米草-土壤系统各组分中的分配比例Fig. 2 Percentage distribution of the net assimilated 13C in S.alterniflora-soil system

表1 不同标记次数后净光合固定13C的量Table 1 Net photosynthesized 13C distribution in each part of S. alterniflora-soil system

2.3 13C脉冲标记互花米草-土壤系统中的标记效率

13C的标记效率是指互花米草-土壤系统中各组分固定13C的量与标记时输入系统中13C的量的百分比。根据互花米草茎、叶、根、根际土壤和土体的13C丰度以及标记时输入系统中13C量，可以计算13C的标记效率。根据加入的标记物，计算出每次标记时输入的13C量为1.51 g。4次标记后的标记效率在 3.47%－4.77%之间，标记效率随标记次数增加而先增加后降低（图3）。尹云锋等（2010）通过 5次脉冲标记使水稻的标记效率为 35%，与Rees et al.（2005）研究的小麦的标记效率大致一致，但本研究标记效率在 3.47%－4.77%，与前人研究相比，相对较低。

图3 互花米草标记效率Fig. 3 Fixed proportion of 13C in S. alterniflora-soil system

3 讨论

3.1 互花米草-土壤系统中13C富集程度

稳定碳同位素技术目前已被广泛应用于各个研究领域，13C标记法与14C标记法相比，具有无放射性、较安全、标记均匀等优点（尹云锋等，2007）。随着稳定碳同位素测定技术的改进和提高，利用稳定碳同位素变化研究各个生长时期植物光合产物的去向，植物的秸秆、残茬或根系在土壤中的分解动态变化和在土壤有机碳不同组分中的分配，已经成为一个重要的方法和手段（Dmjs et al.，2002）。

13C标记可分为连续标记和脉冲标记，本文采用脉冲标记法，在植物生长的各个生育期均提供标记以提高标记效率。本研究中，经过4次13C标记后，互花米草各个器官（叶、茎和根）、根际土壤以及土体的 δ13C值分别为 606.07‰、721.77‰、397.23‰、69.4‰和 29.4‰，这说明本实验标记可以获得较满意的富集13C互花米草材料。这与Lu et al.（2003）的研究一致。Simard et al.（1997）也发现白桦（Betula platyphylla）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）脉冲标记半小时后，其叶子13C值明显发生富集，分别达到660‰、460‰，与本文研究一致。4次标记后，互花米草13C丰度变化表现为茎＞叶＞根＞根际土壤＞土体。安婷婷等（2013）标记玉米1 d后，同一处理组13C丰度变化表现为茎叶＞根＞根际土壤＞土体（刘萍等，2015）；Butler et al.（2004）在苗期对黑麦草进行标记，标记后1 d得出的结果同样如此，均与本研究结论一致。Bromand et al.（2001）利用脉冲标记技术标记 13次后收获测得小麦器官的δ13C值为2140‰－2370‰，与本研究相差2－3倍。说明标记后植物富集13C结果的差异与标记次数、标记时间（安婷婷等，2013）、植物类型及其生长期不同有关。

3.2 互花米草-土壤系统中各组分固定13C量

有研究表明，土壤呼吸损失碳量占同化碳总量的40%以上（Kuzyakov et al.，2001），但需要在特定可控制的实验条件下进行研究，本研究没有考虑呼吸的作用。互花米草固定13C量主要指根、茎、叶、根际土壤和土体固定13C量之和。各组分固定13C量呈现茎、叶、根、根际土壤、土体依序递减的趋势，13C的分配比呈现同样规律。尽管土体中13C变化趋势不明显，但也呈现出明显的上升趋势，这可能是光合固定的13C通过根系将根际沉积物输入土壤，被土壤微生物吸收和利用，导致土体中值有所上升（马真等，2016）。Wu et al.（2010）在矮嵩草（Kobresia humips）草甸上标记32 d后发现31%左右的13C进入地下活根中，Fan et al.（2008）也研究发现，标记27 d后20%－40%的光合碳进入到地下，这都与本研究一致。本研究中，光合作用固定的13C在地上部分（茎、叶）的分配比例在75.36%－81.13%之间，地下部分（根、根际土壤、土体）的分配比例在 18.51%－24.63%之间。与Kuzyakov et al.（2004）研究的小麦、牧草、玉米地上（茎、叶）和地下（根、土体、根际呼吸）部分光合碳的分配比例（表2）相比，互花米草地上部分分配比例相对较大，地下部分分配相对较小，这可能是因为本研究互花米草在室内培养，受条件限制，互花米草地上部分生物量比较小，存在相对浓缩作用（乔云发等，2010），地下部分分配比例相对较小是因为本研究中未考虑土壤和互花米草的呼吸作用。加上小麦、牧草具有较大的植物根系，能固定更多的13C。其他研究者得出柳枝稷（Panicum virgatum）固定13C的比例在42%－79%之间（Chaudhary et al.，2012），蚕豆（Vicia faba）固定13C比例41%－67%（Fan et al.，2008）。

表2 不同植物光合13C的分配比例Table 2 Percentage distribution of the net assimilated 13C of different plants

4 结论

未标记组各组分的13C丰度在4次标记后差异显著；互花米草在4次稳定碳同位素脉冲标记后，植物根、茎、叶、根际土壤以及土体13C丰度值都有明显上升趋势。13C丰度随标记的次数而增加；4次标记固定的13C量分别为52.80、125.20、217.11、276.81 mg·plant-1，各部分固定的13C量随标记次数增加而增加，而且地上部分固定13C量和分配比例都明显大于地下部分。