超高效液相色谱-串联质谱法测定4种浆果中5-硝基邻甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠残留量

许 旭，侯 雪， 韩 梅，邱世婷，毛建霏

(1.中国科学院成都有机化学研究所，四川 成都 610041；2. 四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066；3.农业部农产品质量安全风险评估实验室(成都)，四川 成都 610066；4.中国科学院大学，北京 100049)

【研究意义】植物生长调节剂(PGRs)是一类具有天然植物激素生理活性的人工合成的小分子化合物，能够有效促进、抑制或改变植物生长发育[1-3]。5-硝基邻甲氧基苯酚钠(Sodium 5-nitroguaiacolate, 5NG)和对硝基苯酚钠(Sodium para-nitrophenolate, SD2)作为复硝酚钠的主要成分，是一种高效的PGRs，可通过提高细胞活力、促进细胞原生质流动从而加速细胞生长，提高产量并增强抗逆能力[4-5]。此外，5NG和SD2还作为鱼、虾等生长药物添加剂，广泛应用于水产养殖业中[6]。虽然5NG和SD2毒性较低，但长期食用含有5NG和SD2的食品，会对人类的身体产生潜在的危害[7]。【前人研究进展】目前，国内外对5NG和SD2的研究不够深入，其残留安全期和毒理机制尚不明确，5NG和SD2在食物和环境中的毒性及残留成为近几年来人们越来越关心的问题。虽然，许多国家和组织对可食用植物中常用PGRs的最大残留限量(MRLs)值有各自的规定[8-11]，但对5NG和SD2尚未有明确规定。关于硝基酚类化合物的检测方法主要有分光光度法、电位法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法等[12-16]。HPLC基质干扰严重，灵敏度低，不能提供分析物的结构信息，容易出现假阳性；GC-MS测定时往往需要衍生化，操作繁琐；而LC-MS/MS以保留时间、离子对及离子比率作为定性标准，灵敏度高、准确性好。目前，国内外已有很多采用LC-MS/MS测定食品中其他PGRs残留量的报道[17-19]，但对5NG和SD2的研究较少，不能满足检测样品种类的要求。【本研究切入点】本文通过优化色谱条件及质谱参数，建立了UPLC-MS/MS检测4种水果中5NG和SD2的分析方法。【拟解决的关键问题】以期为浆果中5NG和SD2残留量的快速检测提供便捷的手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC-30 AD UPLC液相色谱仪(日本Shimadzu公司)和AB SCIEX QTRAP 4500串联质谱仪(美国AB公司)，植物生长调节剂标准物质：对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠购自Dr. Ehrenstorfer公司，纯度均>97 %。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸氨均为色谱纯(美国Fisher Scientific公司)。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液配制 分别准确称取对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准品，用甲醇配制浓度为100 mg/L的标准储备液，-18 ℃储存，再移取储备液各1 mL，定容至50 mL，配置成2 mg/L的混合标准工作液。

1.2.2 基质匹配混合标准工作液配制 取不含待测物的蓝莓、树莓、草莓及车厘子样品，按1.3节的前处理方法制得空白基质溶液，并用其稀释混合标准工作溶液，配成0.02、0.04、0.20、0.40、0.80、1.60和2.00 mg/kg的基质匹配混合标准工作溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

提取：准确称取10.0 g(精确至0.1 g)样品于50 mL具塞离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋1 min混匀。

分配：加入4.0 g无水硫酸镁、1.0 g氯化钠，迅速振摇，涡旋2 min，5000 r/min离心5.0 min，取上清液1∶1(v/v)加水稀释后，过0.22 μm滤膜，上机检测。

1.4 超高效液相色谱条件

色谱柱：CAPCELL PKA-C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)；流动相：A为含5 mmol/L乙酸铵和0.1 %甲酸的水溶液，B为甲醇；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。梯度洗脱程序为：0～2 min，10 %B-50 %B；2～6 min，50 %B-90 %B；6～6.1 min，90 %B-10 %B。

1.5 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式、多反应监测(MRM)扫描。电喷雾电压(IS)：-4500 V；离子源温度：550 ℃;雾化气(GS1)：60 psi；辅助气(GS2)：60 psi；气帘气(CUR)：40 psi; 定性离子对、定量离子对、去簇电压(Declusteringpotential: DP)和碰撞能(Collision energy:CE)见表1。

表1 2种植物生长调节剂的保留时间及质谱参数

图1 MRM下对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠的提取离子流色谱图Fig.1 The extracted ion chromatograms of 5NG and SD2 under the MRM

1.6 基质效应

通过相对响应值法(基质效应=空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值)，考察分析物的基质效应。当比值大于1时为基质增强效应，反之，为基质抑制效应[20-21]。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

使用直接进样分析目标化合物的标准溶液，优化5NG和SD2 2种植物生长调节剂的质谱条件。在负离子扫描模式下，发现2种化合物均可产生稳定的[M-H]-，选择[M-H]-作为2种植物调节剂的母离子，逐级优化离子对的碰撞能量和去簇电压，从而得到响应相对更高的MRM相应，优化后的参数设置见表1。基于已经优化的质谱条件，建立LC-MS/MS分析方法。2种植物生长调节剂5NG和SD2的提取离子流色谱图如图1所示。

2.2 基质效应

基质效应是指基质中的某些共提取物组分对待测物的测定准确度的影响。LC-MS/MS中基质成分虽可以不被监测，但会随目标物共流出，从而影响化合物的离子化效率，从而抑制或增强化合物信号[22-23]。这可能是因为非挥发性的共流出成分在毛细管出口尖端时，与分析物竞争电离，阻碍或增强了分析物的离子化效果[24-25]。为了提高待测化合物的测定准确度，应对不同基质产生的基质效应进行评价，从而选择合适方法减小基质效应的影响。本文采用相对响应值法对对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠在不同基质提取液中的基质效应进行评价(表2)。4种水果基质均对对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠有不同程度的基质效应，其中蓝莓、树莓和车厘子主要表现为基质增强效应，而草莓表现为基质抑制效应。因此，基质效应不可忽略，应采用空白基质匹配标准溶液，进行定量分析。

2.3 方法的线性范围和检出限

取1.2.2节的基质匹配混合标准工作溶液，在仪器工作条件下进行分析，采用外标法定量，根据5NG和SD2的定量MRM峰面积(Y)对质量浓度(X)绘制基质匹配标准曲线。以3倍信噪比计算方法检出限，10倍信噪比计算方法定量限。如表3所示：在0.02～2.00 mg/kg范围内，5NG和SD2线性关系良好，相关系数(r)均大于0.9968，方法的检出限在0.28～0.73 μg/kg，定量限在0.93～2.43 μg/kg。

表2 对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠在不同基质提取液中的基质效应

表3不同基质中2种植物调节剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) for two plant growth regulators in different matrices

化合物Compounds基质Matrix线性方程Regression equationrLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)5NG蓝莓Y=8.98×106X-4.16×1040.99970.732.43树莓Y=8.94×106X-1.99×1040.99990.632.10草莓Y=7.86×106X-2.85×1040.99980.541.80车厘子Y=1.59×106X-6855.70.99910.712.37SD2蓝莓Y=5.13×106X+7.31×1040.99910.431.43树莓Y=5.43×106X+9.07×1040.99690.401.33草莓Y=4.93×106X+6.87×1040.99680.321.07车厘子Y=5.53×106X+1.17×1050.99850.280.93

表4 2种植物调节剂在不同基质中的添加回收率及相对标准偏差(n=6)

2.4 方法的精密度和准确度

取空白基质样品，添加适量相当于0.02、0.04、0.40和2.00 mg/kg的混合标准工作溶液，按1.3节的条件平行测定6次。如表4所示：添加回收率在91.75 %～112.67 %，相对标准偏差(RSD)在1.07 %～5.76 %，符合方法学要求。

3 讨 论

本文通过优化色谱条件，建立了超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS)同时测定蓝莓、树莓、草莓和车厘子中5-硝基对甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠残留量的分析方法。样品用乙腈提取，盐析除水后直接离心，取上清液进行检测，无需富集浓缩等特殊净化步骤。而后对基质效应进行评价，4种水果基质均对对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠有不同程度的基质效应，其中蓝莓、树莓和车厘子主要表现为基质增强效应，而草莓表现为基质抑制效应。在0.02～2.00 mg/kg范围内，5NG和SD2的质量浓度与对应的峰面积间线性关系良好，相关系数均大于0.9968。5-硝基对甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠在浆果类水果(蓝莓、树莓、草莓及车厘子)中的检出限(LOD)别为0.28～0.73 μg/kg，定量限(LOQ)为0.93～2.43 μg/kg。在4个添加水平下，样品添加回收试验的平均回收率为91.75 %～112.67 %，相对标准偏差为1.07 %～5.76 %(n=6)。

4 结 论

实验建立了蓝莓、树莓、草莓和车厘子中5-硝基对甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠残留量的快速分析方法。该方法前处理过程简单、方法灵敏度高、线性关系、回收率和精密度均能满足农药残留分析的要求。可作为浆果中5-硝基对甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠的快速确证和测定方法。