铅、镉胁迫对果蝇生长发育和抗氧化能力的影响

2019-04-09李长春姚国新戴余军李国元

西南农业学报 2019年2期

李长春，王永，姚国新，戴余军，李国元

(1. 湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感 432000；2. 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感 432000)

1 材料与方法

1.1 实验材料

拟果蝇(Drosophilasimulans)由湖北大学行为生态与进化生物学研究中心提供。Pb(NO3)2·3H2O、CdCl2·2.5H2O购自天津市风船科技有限公司，均为分析纯。蛋白质定量测定试剂盒(考马斯亮蓝法)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司。恒温光照培养箱(MJX-2508-Z)由上海博迅实业有限公司生产，全自动多功能酶标仪(Enspire)购自美国PerkinElmer公司。

1.2 果蝇的饲养

果蝇培养于5 cm×12 cm平底玻璃试管中。置于(23±1)°C，相对湿度60 %～80 %，光周期14 h:10 h (L/D)的恒温光照培养箱中。培养基配方为：玉米粉62.5 g，红糖50.0 g，酵母粉7.5 g，琼脂粉5.0 g，苯甲酸钠0.1 g，丙酸2 mL，双蒸水500 mL。

1.3 果蝇的染毒处理

通过向培养基添加Pb2+、Cd2+水溶液使果蝇染毒。设置铅、镉单一污染浓度各2个：10 mg/L Pb2+(Pb10)、20 mg/L Pb2+(Pb20)和10 mg/L Cd2+(Cd10)、20 mg/L Cd2+(Cd20)；铅镉复合污染浓度2个：10 mg/L Pb2++ 10 mg/L Cd2+(PC10)，20 mg/L Pb2++ 20 mg/L Cd2+(PC20)；未添加铅镉的培养基作对照(CK)。每个处理设置6个重复。乙醚麻醉后，收集从无污染培养基上8 h内孵化出的果蝇成虫接种于培养基含镉的培养瓶和对照瓶中，每瓶接种雌雄果蝇各10只，5 d后清除果蝇成虫。每处理6次重复。

1.4 生长发育指标的测定

每天早上8:00定时检查，记录每管果蝇开始化蛹和开始羽化时间；分别在各管出现第1个蛹和成虫后的第5天记录各管成蛹的个数和羽化的果蝇数；接种后第10天后每组随机选取10头幼虫称重，羽化当天随机选择各组雌雄成虫各10只称重。性别比 = 雌果蝇数/果蝇总数。

1.5 酶活性的测定

随机收集成熟后第2天的雌雄果蝇，麻醉后称取0.1 g，加入质量(g) ：体积(mL) 9倍的预冷的生理盐水，置冰水混合物上研磨匀浆。4 ℃下，3000 r/min，离心10 min，取上清液。加入4倍体积生理盐水得浓度为2 %的组织匀浆，作为待测液。样本蛋白质含量、总抗氧化能力(T-AOC)、SOD和CAT活性用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒测定。每毫克蛋白每分钟使反应体系的吸光度增加0.01定义为一个总抗氧化能力单位；反应体系中SOD抑制率达50 %时所对应的酶量定义为一个SOD活力单位；每毫克蛋白每分钟内催化降解1 nmol H2O2定义为一个CAT活力单位。

1.6 统计分析

数据用Mean±SE表示。不同处理间的差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。不同处理间平均数的差异显著性采用最小显著差数法(1east significant difference, LSD)进行比较。所有数据均用SPSS 21.0进行处理。

2 结果与分析

2.1 Pb2+、Cd2+单一及复合胁迫对果蝇生长发育的影响

Pb2+、Cd2+单一及复合处理显著延长了果蝇的化蛹时间和羽化时间，不同处理间，化蛹时间(F=20.937，df=6，P<0.001)和羽化时间(F=43.259，df=6，P<0.001)差异显著。相同浓度下，Cd2+单一处理时幼虫化蛹时间和羽化时间大于Pb2+单一处理，Pb2+、Cd2+复合处理时幼虫化蛹时间和羽化时间大于Pb2+、Cd2+单一处理。10 mg/L Cd2+与20 mg/L Pb2+单一处理组之间(P=0.156)，10 mg/L Cd2+单一处理与10 mg/L Pb2++10 mg/L Cd2+复合处理组之间(P=0.334)，以及20 mg/L Cd2+单一处理与20 mg/L Pb2++20 mg/L Cd2+复合处理组之间果蝇化蛹时间的差异不显著(P=0.625)。10 mg/L Pb2+与20 mg/L Pb2+单一处理组之间(P=0.082)，10 mg/L Cd2+、20 mg/L Cd2+单一处理和10 mg/L+10 mg/L 铅镉复合处理组之间果蝇羽化时间的差异不显著(P=0.096，表1)。

表1 Pb2+、Cd2+单一及复合胁迫对果蝇生长发育的影响

注：平均数的多重比较采用LSD法。标注不同字母表示不同处理间差异性显著(P<0.05)。

Note: LSD method was used for multiple comparisons of means. Different letters above columns indicate significant difference among treatments (P<0.05).

Pb2+、Cd2+单一及复合处理明显降低了果蝇体重，幼虫体重(F=65.343，df=6，P<0.001)、雌果蝇体重(F=19.626，df=6，P<0.001)和雄果蝇体重(F=26.095，df=6，P<0.001)受重金属胁迫差异显著。Pb2+、Cd2+单一胁迫时，果蝇体重随浓度的增大显著降低，相同浓度Cd2+胁迫时果蝇成虫体重显著低于Pb2+胁迫时体重，20 mg/L Pb2+单一处理、10 mg/L Cd2+单一处理、10 mg/L +10 mg/L铅镉复合处理之间雌雄果蝇体重差异不显著，20 mg/L Pb2+、Cd2+复合处理和20 mg/L Cd2+单一处理间差异不显著(P<0.05，表1)。

2.2 Pb2+、Cd2+单一及复合胁迫对果蝇对果蝇性别比的影响

Pb2+、Cd2+单一和复合胁迫对果蝇的性别比产生了显著影响(F=15.734，df=6，P<0.001，图1)。10 mg/L Pb2+、Cd2+单一和复合胁迫对果蝇的性别比没有显著影响(P=0.164)。20 mg/L Pb2+、Cd2+单一和复合胁迫下果蝇的性别比显著高于对照(P<0.01)，且20 mg/L Pb2++ 20 mg/L Cd2+复合胁迫和20 mg/L Cd2+胁迫时果蝇性别比显著高于20 mg/L Pb2+胁迫时果蝇的性别比(P<0.01)。

平均数的多重比较采用LSD法。标注不同字母表示不同处理间差异性显著(P<0.05)LSD method was used for multiple comparisons of means. Different letters above columns indicate significant difference among treatments (P<0.05)图1 Pb2+、Cd2+单一及复合胁迫对果蝇性别比的影响Fig.1 Effects of single and combined pollution of Pb2+ and Cd2+ on sex ratio of Drosophila simulans

2.3 Pb2+、Cd2+单一及复合胁迫对果蝇抗氧化能力的影响

Pb2+、Cd2+单一和复合胁迫显著抑制了雌雄果蝇T-AOC、SOD和CAT的活性(图2)，不同处理间果蝇T-AOC活性(雌：F=95.836，df=6，P<0.001；雄：F=210.101，df=6，P<0.001)、SOD活性(雌：F=82.557，df=6，P<0.001；雄：F=244.559，df=6，P<0.001)和CAT活性(雌：F=39.219，df=6，P<0.001；雄：F=6，df=6，P<0.001)差异显著。雌雄果蝇10和20 mg/L Pb2+单一处理间T-AOC活性差异不显著，10 mg/L Pb2+、Cd2+复合处理T-AOC活性显著低于10 mg/L Pb2+单一处理，高于10 mg/L Cd2+单一处理，随着浓度升高，20 mg/L Pb2+、Cd2+复合处理T-AOC活性明显低于对应的单一处理(P<0.05)。Pb2+、Cd2+单一及复合处理下，果蝇体内SOD和CAT活性变化趋势相同，单一处理条件下，果蝇体内SOD和CAT活性分别随Pb2+和Cd2+浓度的增大而显著降低，10和20 mg/L Pb2+、Cd2+复合处理时，SOD和CAT活性显著低于对应的单一处理(P<0.05)。

3 讨论

果蝇是毒理学研究中有重要潜在价值的模式生物[12]，然而目前研究较多的是黑腹果蝇Drosophilamelanogaster，关于拟果蝇的报道很少。有研究指出重金属胁迫可显著抑制果蝇D.melanogaster的生长、繁殖[13]。本研究中，Pb2+、Cd2+单一和复合胁迫下，果蝇的化蛹时间和羽化时间显著延长，蛹重和成虫体重显著下降，且表现出明显的浓度依赖性，此结果表明，拟果蝇可以对Pb2+、Cd2+污染提供较好的指示作用。重金属可以与细胞内的分子直接作用，影响其正常的活性和生理功能，还可以通过引起细胞内ROS的过量产生，对细胞产生间接损伤[10]。生物体可以对重金属胁迫进行有效的抵御，但是以降低其生长发育为代价的[14]。相同浓度的Cd2+对果蝇生长发育和抗氧化能力的影响显著高于Pb2+，表明Cd2+比Pb2+对果蝇有更大的毒性。在Pb2+、Cd2+浓度相同的情况下，复合胁迫比单一胁迫对果蝇的生长发育和抗氧化能力的抑制作用更强，说明二者具有协同作用，加大了对果蝇的毒害[15-16]，进一步证实复合污染下两种或多种有毒物质对生物体的毒害效应与单一物质有所不同[4,17]。

A.总抗氧化能力；B. 超氧化物歧化酶；C.过氧化氢酶。平均数的多重比较采用LSD法。标注不同大写字母表示雌果蝇不同处理间差异性显著，不同小写字母表示雄果蝇不同处理间差异性显著(P<0.05)A. T-AOC；B. SOD；C. CAT. LSD method was used for multiple comparisons of means, Different uppercase letters and lowercase letters denote a significant difference among females and males, respectively (P<0.05)图2 Pb2+、Cd2+单一及复合胁迫对果蝇抗氧化能力的影响Fig.2 Effects of single and combined pollution of Pb2+ and Cd2+ on antioxidant capacity of Drosophila simulans

重金属胁迫下，不同生物在不同的情况下会采取不同的抗氧化策略。虫体内SOD、CAT等抗氧化酶活性增强或抑制的现象都有报道，酶活性变化特点与物种类型、发育阶段、性别，以及重金属的种类、浓度、形态和作用时间等因素有关[18]。如，舞毒蛾Lymantriadispar在不同发育阶段采取不同抗氧化策略抵御Cd2+造成的胁迫，饲料中添加50 μg Cd/g干重时，舞毒蛾各龄期幼虫SOD活性相比对照组没有显著变化，CAT活性在3龄期显著下降，在6龄期显著升高[19]。中华稻蝗Oxyachinensis幼虫在Cr6+胁迫下SOD活性随处理浓度变化不明显，CAT、GPx活性随Cr6+浓度增加呈先增加后降低的趋势[20]。低浓度的镉可以刺激文哈Meretrixmeretrix体内SOD和CAT活性的提高，但高浓度的镉则抑制它们的活性[21]。本研究中，果蝇体内的总抗氧化能力T-AOC，以及SOD和CAT 的活性均表现为抑制现象，且与胁迫的重金属浓度相关，可能与果蝇持续受到高浓度重金属胁迫有关，这与陈壁锋等[22]研究结果，黑腹果蝇体内SOD活性随Pb2+浓度升高而降低相似。说明昆虫抗氧化系统抵御氧化胁迫的能力是有限的，低剂量的重金属可以诱导虫体抗氧化基因的表达，高剂量重金属的持续胁迫则会造成抗氧化系统的破坏[23]。