甜菜夜蛾细胞色素P450基因的克隆与分析

袁 远，高 熹，张连根，倪 峰，高 俨，吴毅歆，喜 超，朱家位*

(1.云南农业大学，云南 昆明 650201；2.云南高原特色产业研究院，云南 昆明 650201)

【研究意义】细胞色素P450单加氧酶系统是主要的解毒酶系统之一，其参与昆虫中对各种生物杀虫剂体内反应及昆虫自身化学组成的新陈代谢。细胞色素P450是一种促使电子从NADPH向P450氧化还原剂[1-2]。【前人研究进展】昆虫细胞色素P450于1967年由Ray首先发现[3]。目前，已研究了20多种昆虫的细胞色素P450。研究表明P450在昆虫对杀虫剂代谢过程中起关键作用，昆虫产生杀虫剂抗药性的重要原因是由于一个或几个P450基因过量表达导致P450解毒酶量的增加导致体内单加氧酶系介导的代谢反应，从而引起昆虫对杀虫剂产生抗性[4]。近年来，细胞色素P450新基因被不断克隆其结构，其表达调控、抗性关系的研究取得了一定的进展[5]。P450酶系统在昆虫体内多种内源物的代谢中起到至关重要的作用，同时参与昆虫体内激素等物质的生物合成和降解[6-7]以及脱皮素平衡的多个步骤[8]。甜菜夜蛾Spodopteraexigua是中国危害严重的害虫之一，多年来对于甜菜夜蛾的防治手段主要是依靠化学防治。但是，长期滥用化学农药导致甜菜夜蛾对多种农药产生了很强的抗药性。研究该害虫抗药性机制，将有助于对该害虫进行有效的防治。【本研究切入点】本研究以甜菜夜蛾为研究对象，采用RACE技术，克隆甜菜夜蛾细胞色素P450基因，并利用生物学软件对其基因结构进行分析。【拟解决的关键问题】为探究甜菜夜蛾产生抗药性的机理提供分子依据，同时为其他学者研究昆虫P450基因提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 试虫

甜菜夜蛾成虫采自云南省昆明市斗南玫瑰种植基地，供作试验用蛾。

1.2 总RNA的抽提

供试虫体的总RNA提取采用王玉成等方法[9]。

1.3 RACE

以新鲜抽提的甜菜夜蛾总RNA为材料，利用CLONTECH公司的Smarttm RACE cDNA Amplification Kit，合成3′和5′ RACE cDNA模板。根据细胞色素P450保守结构域序列，设计基因特异性3′ RACE简并引物(3′ RACE gene-specific primer，3′ GSP)，使用RACE试剂盒中的UPM引物，通过PCR获得P450的3′端序列，依据获得的3′端序列设计基因特异性5′引物扩增获得5′端序列。具体方法及步骤采用朱家颖等方法[10]。

1.4 克隆及序列测定

1.4.1 连接反应 将PCR扩增产物回收液与Pmd19-T载体进行连接后，室温抚育1 h，4 ℃过夜。反应体系：pMD19-T (50 ng/μl) 1 μl，Solution I 5 μl，PCR纯化产物 4 μl，总体积10 μl。

1.4.2 感受态细胞的制备 采用CaCl2法[11]制备大肠杆菌感受态细胞。

1.4.3 转化和筛选 取感受态细胞100 μl加入10 μl连接物，冰浴30 min。42 ℃水浴热激90 s立刻置于冰上10 min，加入预冷LB培养液900 μl。37 ℃摇床低速培养1 h后3000 r/min离心30 s，吸去上清至剩余200 μl，将沉淀轻轻悬浮。取悬浮液100 μl涂布在含Amp(50～100 mg/mL)的LB平板(先涂布4 μl 200 mg/LIPTG和40 μl 20 mg/mLX-Gal)静置30 min，待菌液被完全吸收后37 ℃倒置培养16 h。当出现明显而又未重叠的单菌落时，拿出平板筛选白色单菌落置5 mL含Amp(50～100 mg/mL)的LB培养液中，37 ℃培养8～12 h，菌液浑浊，4 ℃保存。

“*”星号表示终止子The asterisk marked the translation-termination codon图1 SexiP450基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences of SexiP450 and deduced amino acid sequences

1.4.4 送检测序 含目的片段质粒转化大肠杆菌感受态细胞，涂平板后通过蓝白斑筛选以及菌液PCR检测阳性重组克隆，菌液送公司测序。

1.5 序列分析

核苷酸的翻译和氨基酸比对使用Genetyx-min 5.1和ClustalX 1.83软件分析[12]。蛋白信号肽预测使用SignalP在线分析工具[13]。

2 结果与分析

2.1 cDNA克隆及序列分析

将3′和5′ RACE扩增所得目的基因片段拼接后，得甜菜夜蛾色素细胞P450基因的全长序列为894 bp，开放阅读框411 bp，3′和5′端非编码序列分别为79和213 bp，命名为SexiP450(图1)。该基因编码194个氨基酸，推导的氨基酸序列编码194个氨基酸。SignalP预测编码蛋白质的分子量为22.30 kDa，等电点为8.22，该蛋白无信号肽序列(图2)。

2.2 同源性比较和分析

SexiP450与其它昆虫细胞色素P450基因的氨基酸序列ClustalX对比结果见图3。从图可见，其中与斜纹夜蛾Spodopteralitura、甘蓝夜蛾Mamestrabrassicae、棉铃虫Helicoverpaarmigera和谷实夜蛾Helicoverpazea细胞色素P450的相似性分别为42 %、41 %、39 %和42 %。

图2 蛋白质信号肽分析Fig.2 Analysis of signal peptide protein

3 讨 论

细胞色素P450基因在昆虫抗药性及对寄主植物适应性中的重要作用引起了广大学者的重视。目前NCBI中己报道了多个昆虫的P450基因序列，如赤拟谷盗[14]、家蚕[15]、黑腹果蝇[16]、意大利蜜蜂[17]、丽蝇蛹集金小蜂[18]、人虱[19]等。昆虫细胞色素p450基因的研究从目标昆虫中克隆获得一个细胞色素P450基因的全长cDNA序列进行分析，目前已有大量有关细胞色素P450基因的研究报道[5,20]。本研究利用RACE技术，从甜菜夜蛾中克隆获得一个细胞色素P450基因的全长cDNA序列，根据其cDNA序列推导的氨基酸序列表明，SexiP450特征：相对分子量为22.30 kDa，通过分析发现并无信号肽。近年随着基因组学的不断发展，许多细胞色素P450基因逐渐从昆虫基因组中被发掘。据此，更多的甜菜夜蛾细胞色素P450基因有待克隆获得。同源性比对分析发现，甜菜夜蛾细胞色素P450基因与其它昆虫细胞色素P450基因在氨基酸水平上与同目昆虫的相似性很高，而与其他目的昆虫的相对比较低一些。细胞色素P450基因结构多样、分布广泛、功能复杂及基因调控性多样，随着基因组学的发展越来越受到学界的广泛关注，其在昆虫的生长发育、取食等过程中的作用正逐步被解开，本研究结果为科研人员深入探究昆虫P450基因结构与功能提供了方法借鉴。随着对P450研究的深入其与昆虫产生抗药性之间的分子机理必将会被人类揭示。

相同和相似的氨基酸分别用黑色和灰色标出。Sexi为斜纹夜蛾(AAP80766)，Mbra为甘蓝夜蛾(AAR26518)，Harm为棉铃虫(AAV28704)，Hzea为谷实夜蛾(ABH09252)The identical and similar amino acids mark in dark and grey. Sexi is Spodoptera litura (AAP80766); Mbra is Mamestra brassicae (AAR26518); Harm is Helicoverpa armigera (AAV28704); Hzea is Helicoverpa zea (ABH09252)图2 SexiP450与其它昆虫P450基因的氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment between SexiP450 and other insects’ cytochrome P450 gene

4 结 论

利用RACE技术，从甜菜夜蛾中克隆获得1个细胞色素P450基因的全长cDNA序列，大小为894 bp，开放阅读框411 bp，3′和5′端非编码序列分别为79和213 bp，编码194个氨基酸。利用SignalP，Genetyx-min 5.1和ClustalX生物信息学软件对其基因结构进行分析预测显示该蛋白无信号肽序列，其氨基酸序列比对与斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、棉铃虫和谷实夜蛾细胞色素P450的相似性分别为42 %、41 %、39 %和42 %。通过对该基因的分析预测可为探究甜菜夜蛾产生抗药性的机理提供参考，同时为其他学者研究昆虫P450基因提供借鉴和参考。