硫酸铜和水杨酸对青稞生理生化指标的影响

张 丽，乔 枫

(青海师范大学生命科学学院 青藏高原资源与环境教育部重点实验室，青海 西宁 810008)

【研究意义】硫酸铜胁迫是主要非生物胁迫类型之一[1]。铜(Cu)作为高等植物生长发育过程中的必需元素，是细胞色C氧化酶、酪氨酸酶、赖氨酸氧化酶，多巴胺β羟化酶等多种酶所必需的组分[2-3]，在作物的生长状况、产量和品质方面发挥着重要作用。在植物体内，铜以铜锌超氧化物歧化酶的形式对植物体的光合作用和呼吸作用进行调控；器官机能下降甚至病变等是机体缺少铜元素的病症[4]；过量的铜在植物体内聚集，使植物体中的叶绿体酶失活，叶绿体分解加快，植物的光合作用、呼吸作用、代谢作用受到抑制，导致植株生长受阻[5]；铜含量过高还可以使植物体的细胞膜透性增大，可溶性物质外渗，电导率增大，造成植物渗透胁迫和离子胁迫，损伤类囊体膜，使植物失去绿色，影响亚硝酸还原酶活性，从而导致植物对N的吸收受阻[6]；并且植物的细胞组分还会受到破坏，使其细胞出现失水现象，改变了正常细胞的生理生化代谢，对其造成严重伤害，甚至导致植物最终死亡[7-8]。近年来工业污染愈加严重，环境中铜离子的含量急剧上升，过量的铜不但使农作物中金属含量超标，使其抗逆性降低，而且还可以以食物的方式进入人体，通过食物链危害人类的身体健康[9]。【前人研究进展】水杨酸(SA)又名邻羟基苯甲酸，一种简单的酚类化合物，是细胞内的信号传递分子，是原核生物和真核生物所产生的次生代谢产物，在逆境条件下，可作为植物抗逆作用的重要信号和调节生理作用的重要因子，被认为是一种新型植物激素，对植物抗盐、抗病、抗热、抗旱、抗寒和耐重金属性等逆境过程具有重要作用[10-13]。研究发现，用适宜浓度的SA处理种子，种子会加快萌发和生长[14-16]。水杨酸还可用于皮肤疾病治疗[17]。青稞(Hordeumvulgare)作为禾本科一类适应性强的高原谷类作物，具有耐高寒、生长周期短、产量高等特点，主要生长于我国西北、西南，特别是青海、西藏等地，是青藏高原地区最主要的粮食作物[18-19]，而且是唯一可以在海拔4500 m以上的高寒地带正常成熟的农作物。早在新石器时期我国就有青稞栽培的记录，青藏高原地区青稞的栽培历史也有3500年[18]。青稞具有极其丰富的食用和药用价值，其高含蛋白质、高纤维和丰富的维生素，低含脂肪、糖等特点，在食品和医疗保健方面的得到了应用[20]。《本草拾遗》对于青稞除湿益气、止泻、强筋力的功效进行了记载。【本研究切入点】本文研究硫酸铜、水杨酸胁迫对青稞生理、生化响应及抗性机理，从生理生化的角度揭示硫酸铜、水杨酸胁迫对青稞的生理毒性。虽然人们对重金属和有机酸胁迫有一定的了解[21-23]，但重金属和有机酸对于青稞的影响研究较少，探究水杨酸和硫酸铜处理对青稞的形态结构和代谢特点的影响。【拟解决的关键问题】可为进一步研究逆境条件下青稞的生长状况和幼苗中酶活性的变化过程奠定基础，进而对其调控机制进行研究。

表1 实验处理

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验材料是由青海大学农林科学院作物所提供的青稞(北青6号)。水杨酸，由郑州翰硕化工原料有限公司生产，用去离子水配制成100 μm/L。硫酸铜(CuSO4·5H2O)，由上海开诺医药科技有限公司生产，用去离子水配制成 600 μM/L母液，试验时稀释成所需质量浓度。

1.2 实验处理

选颗粒饱满的北青6号种子，用自来水冲洗数次，用75 %的乙醇溶液消毒10 min，蒸馏水冲洗3次，将种子放入铺有2层滤纸的直径20 cm的培养皿内，每个培养皿放50粒。并按SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件，设置6个不同强度等级的胁迫条件，待青稞种子长出2片子叶开始处理，期间及时用6个处理(表1)培养，分别编号，每个处理重复3次，持续10 d后，开始测青稞幼苗生理指标。

1.3 测定指标和方法

用比色法 CAT活性[24]；用愈创木酚法测定过氧化物酶POD活性[25]；用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛MDA的含量[26]；用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶SOD活性[27]；抗坏血酸过氧化物酶APX活性测定参照Nakano和Asada的方法[28]。

2 结果与分析

2.1 青稞过氧化氢酶活性的影响

SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件对青稞CAT酶活性的影响见图1。

与对照组处理1相比，处理2(100 μM SA)、处理5(600 μM CuSO4)情况下青稞幼苗CAT酶的活性都明显升高(P< 0.05)，而处理3(20 μM CuSO4)、处理4(100 μM SA+150 μM CuSO4)和处理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)情况下青稞幼苗的CAT活性无显著性差异。相比于硫酸铜单独处理条件，在水杨酸和硫酸铜混合处理下青稞幼苗CAT活性有所下降但不明显，可能是水杨酸和硫酸铜混合处理时，其中水杨酸可缓解硫酸铜的毒害作用，从而抑制了青稞幼苗CAT活性的升高 。

图中小写字母不同表示差异具有统计学意义(P<0.05)；图中横坐标表示：处理1：CK，处理2：100 μM SA，处理3：150 μM CuSO4，处理4：100 μM SA+150 μM CuSO4，处理5：600 μM CuSO4，处理6：100 μM SA+600 μM CuSO4，下同图1 CuSO4和SA处理对青稞CAT活性的影响Fig.1 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley CAT

2.2 CuSO4和SA处理对青稞过氧化物酶活性的影响

随着Cu2+和SA质量浓度增大青稞幼苗中POD活性逐渐升高(图2)，并且处理4(100 μM SA+150 μM CuSO4)、处理5(600 μM CuSO4)、处理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)下，POD酶活性显著增高(P<0.05)，分别提高了70.62 %、84.17 %、94.8 %。

2.3 CuSO4和SA处理对青稞丙二醛活性的影响

SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件对青稞MDA活性的影响见图3。

图中小写字母不同表示差异具有统计学意义(P<0.05)。图中横坐标表示，处理1： CK，处理2：100 μM SA，处理3：150 μM CuSO4，处理4：100 μM SA+150 μM CuSO4，处理5：600 μM CuSO4，处理6：100 μM SA+600 μM CuSO4图2 CuSO4和SA处理对青稞POD活性的影响Fig.2 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley POD

图3 CuSO4和SA处理对青稞MDA活性的影响Fig.3 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley MDA

与对照组相比，处理2(100 μM SA)、处理3(20 μM CuSO4)、处理4(100 μM SA+150 μM CuSO4)下，青稞幼苗中丙二醛的含量无显著性差异；处理5(600 μM CuSO4)和处理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)情况下的青稞幼苗中丙二醛的含量显著升高(P<0.05)，分别升高了56.1 %和63.8 %，高的胁迫浓度增加MDA含量。

2.4 CuSO4和SA处理对青稞超氧化物歧化酶活性的影响

SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件对青稞SOD活性的影响见图4。

SA、CuSO4单因素低浓度时，青稞叶片SOD含量的变化不明显，但随着胁迫浓度的增大，各胁迫组的SOD含量上升，其中处理4～6 SOD含量显著上升(P<0.05)。

2.5 CuSO4和SA处理对青稞抗坏血酸过氧化物酶活性的影响

SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件对青稞SOD活性的影响见图5。

与CK组相比，SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素胁迫对青稞叶片APX活性的影响不显著。

2.6 CuSO4和SA处理对青稞叶绿素含量的影响

SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件对青稞叶绿素含量的影响见图6。

图4 CuSO4和SA处理对青稞SOD活性的影响Fig.4 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley SOD

图5 CuSO4和SA处理对青稞APX活性的影响Fig.5 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley APX

图6 CuSO4和SA处理对青稞幼苗叶绿素含量的影响Fig.6 Effect of CuSO4 and SA on chlorophyll content of highland barley

无论是SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4复合胁迫，各胁迫条件下北青6号叶片中的叶绿素含量，均随重金属和有机酸胁迫浓度的增大而呈不断下降的趋势，胁迫浓度与叶绿素含量之间均呈显著负相关性。

2.7 CuSO4和SA处理对青稞发芽率，株高，根长的影响

SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素等不同胁迫条件对青稞发芽率，株高，根长的影响分别见图7～9。

北青6号在单因素及其双因素复合胁迫下，株高、根长均表现出明显的毒害症状，其发芽率、株高、根长总体呈下降趋势，说明SA或CuSO4单因素及其SA+CuSO4双因素复合胁迫均能抑制北青6号的生长，并随各胁迫浓度的升高其抑制作用也增大。

图7 CuSO4和SA处理对青稞发芽率的影响Fig.7 Effect of CuSO4 and SA on the germination rate of highland barley

图8 CuSO4和SA处理对青稞幼苗株高的影响Fig.8 Effects of CuSO4 and SA on the height of highland barley seedlings

图9 CuSO4和SA处理对青稞根长的影响Fig.9 Effects of CuSO4 and SA on the root length of highland barley

由图7～9可知，与对照组处理1相比，从处理3(100 μM SA)至处理6(100 μM SA+600 CuSO4)株高、根长基本呈下降趋势，但没有达到显著性水平。由图8可以看出，与CK相比处理3(20 μM CuSO4)至处理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)，青稞幼苗的株高显著降低(P<0.05)，分别降低了61.7 %、69.5 %、71 %、73.1 %。由图9可以看出，与对照相比其中处理3(20 μM CuSO4)至处理6(100 μM SA +600 μM CuSO4)中青稞幼苗的根长显著下降(P<0.05)，分别下降了95 %、91 %、99 %、96.5 %；并且在SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素复合胁迫下，株高降低率比根长的降低率大，说明SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素复合胁迫对株高的抑制作用比对根部的抑制作更强。但SA、CuSO4单因素与SA+CuSO4双因素复合之间的差异显著性并不高， 即SA、CuSO4单因素胁迫对青稞生长的抑制作用和复合胁迫的作用相似。

3 讨 论

众多研究表明，重金属和有机酸对植物的胁迫作用主要表现在生长状况、叶绿素含量及植物体内抗氧化酶活性变化等方面[29]；多立安等[30]对在金属离子胁迫条件下黑麦草生长状况进行研究时发现，重金属离子对根系生长具有抑制作用，使其叶绿素含量降低。吴月燕[31]在2009年研究重金属胁迫对5个常绿阔叶树种生理生化特性的影响提出，不同浓度的重金属处理下，SOD、POD和CAT的活性均呈现出先升后降的趋势。张帆等[32]研究外源水杨酸诱导对番茄幼苗抗冷性的影响时发现，水杨酸能有效提高番茄幼苗的抗低温能力,使其叶绿素、脯氨酸含量、SOD、POD、CAT活性升高,相对电导率、可溶性蛋白含量、MDA含量降低。本实验研究结果表明，SOD、POD和CAT变化趋势与前人研究不太相同，随着CuSO4、SA单一及复合胁迫浓度的升高，抗氧化酶CAT、POD、SOD活性增加，可能是因为硫酸铜和SA的混合溶液产上了新的物质，对植物的生长发育影响较大。北青6号的株高、 根长、叶绿素含量等生理指标均出现下降的趋势，说明CuSO4、SA单因素或其双因素复合胁迫均能不同程度地抑制青稞的生长，且随浓度的提高产生的抑制作用也增大。CuSO4、SA单因素或其双因素复合胁迫导致青稞的叶绿素含量降低的原因可能是由于CuSO4、SA与相关酶作用，抑制叶绿素前体的合成，促进叶绿素分解或直接破坏叶绿体结构， 从而降低叶绿素含量说明，一些重金属对某一生长指标的影响往往表现在低浓度具有促进作用,而高浓度又存在明显的抑制效应。

当植物处于逆境时，反映细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反映的强弱的丙二醛(MDA)含量增加，导致膜脂过氧化，膜的功能和结构遭到破坏，对植物造成伤害。因此，在CuSO4、SA胁迫下，叶绿体内的氧活化成活性氧，对叶绿体结构和功能产生不同程度的伤害。 超氧化物歧化酶(SOD)在植物清除活化氧方面起到重要作用。CAT有清除体内氧自由基的作用。本研究表明，青稞对低浓度的CuSO4、SA胁迫环境具有一定的适应能力。探究水杨酸和硫酸铜胁迫下青稞种子根的生长状况和酶活性的变化，可为进一步研究水杨酸和硫酸铜处理下青稞种子在逆境胁迫条件下的生理机制奠定基础。