产胞外多糖红曲霉液态发酵培养基的筛选
2019-04-08张子祎李月婵杨薇
张子祎，李月婵，杨薇
（天津农学院 基础科学学院，天津 300384）
据《本草纲目》记载，红曲作为1种我国传统的中药，具有健中消食、活血化瘀的疗效[1]。红曲霉作为其主要的生产菌种，被广泛应用于食品、医药、化工等领域。红曲霉胞外多糖是红曲霉的次级代谢产物，是从红曲霉的菌丝体、发酵液和子实体中分离出来的一种水溶性胶质多糖[2]，具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抑菌性[5]与提高免疫力[6]等多种功能。长期以来，我国对红曲霉菌的研究大多集中在色素[7]、胆固醇抑制剂及洛伐他汀等方面[8]，少数学者也已开始研究红曲霉胞外多糖的相关生产工艺[9]及其抗氧化性特性[10]，但缺少对于高产胞外多糖的红曲霉菌株培养基质筛选方面的研究。因此，本试验以红曲霉作为生产菌株，以大米粉为培养基的主要基质进行液态发酵，以发酵液中胞外多糖的含量作为指标，对培养基的成分进行优化，从而筛选出高产胞外多糖的培养基组成。
1 试验材料
1.1 菌种
红曲霉由江南大学提供。
1.2 培养基
斜面培养基：麦芽汁固态培养基。
种子培养基：麦芽汁液态培养基。
发酵原料：市售东北优质大米、市售大豆粉。
1.3 试剂
葡萄糖、浓硫酸、苯酚均为分析纯。
2 试验方法
2.1 种子的制备
取250 mL三角瓶，倒入100 mL种子培养基，115 ℃灭菌20 min。取1 mL孢子悬浮（孢子浓度为2.25×106个/mL）于灭菌的种子培养基中，置于摇床中培养，培养条件为32 ℃，160 r/min，培养时间为72 h。
2.2 红曲霉生长过程中多糖含量的测定
取250 mL三角瓶，大米磨成细粉，装料量5 g，蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌30 min。接种1 mL种子培养液，置于摇床中培养，培养条件为32 ℃，160 r/min。每隔24 h取样，检测发酵液中多糖的含量，并向发酵液中滴入碘液，观察现象，判断发酵液中是否存在淀粉。
2.2.1 标准曲线的制作
用天平称取10.0 mg葡萄糖，将称取好的葡萄糖放入100 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入蒸馏水，直至100 mL定容刻度处。分别取定容后的溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于干净的100 mL容量瓶中，按照以上方式，分别加蒸馏水定容到100 mL刻度处。各取2.0 mL定容后的溶液，再取1份2 mL的蒸馏水，分别标号为1～6，6为空白对照。将6份溶液分别加入5%的苯酚1.0 mL，再分别加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后，静置冷却20 min，使之反应充分。将冷却后的溶液用紫外分光光度计测量光密度值，使用波长为490 nm，每次测量均将6号对照组放在第一个，作为空白对照。记录数据后，以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，测得的光密度为纵坐标，绘制完成回归方程，得到标准曲线。
2.2.2 发酵液中多糖的检测
取待测发酵液15 mL，4 000 r/min离心20 min，取上层清液1 mL定容至100 mL混匀制成稀释液。取稀释液1 mL于试管中，加入1 mL蒸馏水，采用苯酚-硫酸法测定发酵液中的多糖含量。
2.3 发酵培养基的优化
2.3.1 氮源的选取与用量
2.3.1.1 氮源的确定
以大米粉作为主要基质，同时分别选取蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、玉米粉、L-谷氨酸和硝酸铵作为补充氮源。取蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、玉米粉、L-谷氨酸和硝酸铵各0.5 g，分别装入6个250 mL三角瓶中，再分别加入4.5 g大米粉及100 mL蒸馏水，摇匀，121 ℃灭菌30 min。红曲霉种子的接种量为1 mL，培养条件32 ℃，160 r/min，培养120 h，测定发酵液中多糖的含量。
2.3.1.2 氮源添加量
以大米粉为主要基质，将大豆粉分别以5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/mL添加到大米粉基质中，进行液态发酵。总装料量为5 g，蒸馏水100 mL，红曲霉种子的接种量为1 mL，培养条件32 ℃，160 r/min，培养120 h，测定发酵液中多糖的含量。
2.3.2 无机盐的选取与用量
2.3.2.1 选取无机盐
以大米粉作为主要基质，同时分别选取KCl、KH2PO4、NaCl、MgSO4、MnSO4、CaCl2、CuSO4、FeCl3、FeCl2、ZnSO410种无机盐。取250 mL三角瓶10个，总装料量为5 g，将以上10种无机盐以0.05 mg/mL的添加量加于大米培养基中，再加入100 mL蒸馏水，摇匀，121℃灭菌30 min。红曲霉种子的接种量为1 mL，培养条件32 ℃，160 r/min，培养120 h，测定发酵液中多糖的含量。
2.3.2.2 无机盐添加量
以大米粉作为主要基质，选取KCl、KH2PO4、NaCl 3种无机盐进行正交试验，并确定相关无机盐的添加量。
2.3.3 验证试验
以通过2.3.1和 2.3.2试验筛选所得培养基成分，进行3次验证试验。
3 试验结果
3.1 红曲霉生长曲线
为确定本试验菌种的生长情况，在液态发酵条件下每隔24 h取样，对发酵液的生物量进行测量，结果如图1。
图1 红曲霉生长曲线
红曲霉在麦芽汁液体培养基中进行液态培养，培养72 h时，发酵液中生物量达到最大值。因此，在制备种子培养基的过程中，应选取发酵液中生物量达到最大值时（72 h）停止发酵，将此时的发酵液作为种子培养基进行后续发酵。
3.2 红曲霉胞外多糖测定
3.2.1 葡萄糖标准曲线
红曲霉胞外多糖采用苯酚-硫酸法测定，此法简单、快速、灵敏、重复性好，检测同种糖仅制作1条标准曲线即可。为了确定葡糖标准曲线，在波长为490 nm的条件下，以葡萄糖标准溶液的浓度为横坐标，测得的光密度为纵坐标，绘制曲线得出回归方程，结果如图2。
图2 葡萄糖标准曲线
图中曲线R2＞0.99，说明此标准曲线具有良好的线性关系，该测定方法具有可信度。
3.2.2 红曲霉生长液中多糖含量
为确定红曲霉生长过程中胞外多糖的产生情况，以大米粉作为全部基质对红曲霉进行液态培养，每隔24 h取样，检测发酵液中多糖的含量，结果如图3。
图3 以大米粉为基质液态培养过程中多糖的含量
发酵培养初期虽然检测得到的多糖含量较高，但通过加碘试验证明，发酵液中存在大量的淀粉，这是由于发酵初期培养基中的淀粉成分还没有被菌体完全利用，在多糖检测时，淀粉被硫酸水解成单糖而被检测出来。当发酵至120 h时，通过加碘试验验证发现，培养基中的淀粉已被消耗完全，此时发酵液的多糖含量为51.0 mg/mL，达到最大值。因此，该红曲霉菌株以大米粉作为基质，在发酵120 h时胞外多糖的含量达到最大值，多糖含量为51.0 mg/mL。
3.3 发酵培养基的优化
3.3.1 氮源的选择与用量
3.3.1.1 确定最佳氮源
为了确定培养基质中的最佳氮源，以大米粉作为主要基质，分别选取蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、玉米粉、L-谷氨酸和硝酸铵作为补充氮源，进行液态培养，测定120 h发酵液中多糖的含量，结果如图4。
图4 不同补充氮源对红曲霉液态发酵产胞外多糖的影响
以大豆粉作为补充氮源培养120 h，发酵液中的多糖含量达到最大值70.1 mg/mL，明显高于以玉米、L-谷氨酸、酵母提取物及硝酸铵作为补充氮源发酵所得的多糖含量。因此，选择大豆作为补充氮源更利于红曲霉发酵产生胞外多糖，较以大米粉作为基质的多糖产量高37.4%。
3.3.1.2 氮源添加量
为了确定作为最佳氮源的大豆粉的最适添加量，将大豆粉以不同比例添加至培养基中，进行液态发酵，测定120 h发酵液中多糖的含量，结果如图5。
图5 大豆粉不同添加量对红曲霉液态发酵产胞外多糖含量的影响
当大豆粉的添加量为10 mg/mL时，红曲霉液态发酵所产胞外多糖达到73.2 mg/mL。因此，选择10 mg/mL大豆粉既可以满足红曲霉生长过程中对于氮源的需求，又有利于发酵过程中多糖物质的积累，较单纯以大米粉作为基质的多糖产量高43.5%。
3.3.2 无机盐的优化
3.3.2.1 选取无机盐
无机盐作为重要的生长因子，对菌体的生长有着非常重要的意义，为确定高产胞外多糖红曲霉菌株培养基质中无机盐的含量，以大米粉为主要基质，选取KCl、KH2PO4、NaCl、MgSO4、MnSO4、CaCl2、CuSO4、FeCl3、FeCl2、ZnSO410种无机盐，分别以0.05 mg/mL添加于各自培养基中，进行液态培养120 h随即停止培养，测定发酵液中多糖含量，结果如图6。
图6 不同无机盐对红曲霉液态发酵过程中产胞外多糖的影响
在所选取的10中无机盐中，发酵液中添加KCl、KH2PO4、NaCl的多糖含量要远高于其他无机盐，且比单纯以大米粉发酵培养的多糖产量高，有利于红曲霉发酵过程中多糖的积累。其他无机盐对红曲霉发酵过程中胞外多糖的积累有一定的抑制作用。因此，选取KCl、KH2PO4、NaCl作为红曲霉液态发酵的培养基成分。
3.3.2.2 确定无机盐添加量
为更进一步确定利于红曲霉产胞外多糖的无机盐最适添加量，分别以0.05、0.10、0.15 mg/mL作为KCl、KH2PO4、NaCl的添加量进行正交试验（表1），从而确定3种无机盐的最适添加量。
表1 正交试验确定无机盐的添加量 mg/mL
如表1所示，对正交试验结果进行均值和极差分析，3种无机盐对发酵过程中多糖积累的影响程度为KCl＞KH2PO4＞NaCl，且KCl、KH2PO4、NaCl的添加量均取0.15 mg/mL为宜。
3.3.3 验证试验
以40 mg/mL大米粉作为培养基的主要基质，添加10 mg/mL的大豆粉作为补充氮源，0.15 mg/mL KCl、0.15 mg/mL KH2PO4、0.15 mg/mL NaCl作为无机盐，对红曲霉进行液态发酵120 h，测定发酵液中胞外多糖的含量，并重复3次试验。试验结果见表2。
表2 正交试验确定无机盐的添加量 mg/mL
通过3次验证试验，证实用该培养基对红曲霉进行液态发酵120 h，发酵液中胞外多糖的平均含量为112.3 mg/mL，约是单纯以大米粉作为全部基质进行液态发酵所产多糖含量的2倍。因此，筛选出的培养基更有利于发酵过程中胞外多糖的生成和积累，且该培养基成分无毒、易获得，具有良好的实用性。
4 结论
在对红曲霉进行液态发酵产胞外多糖的初步研究中，本试验确定发酵培养基以40 mg/mL的大米粉作为主要基质，以10 mg/mL大豆粉作为补充氮源，进行液态发酵120 h，比较适合胞外多糖的积累。另外，还发现无机盐KCl、KH2PO4、NaCl对红曲霉液态发酵过程中胞外多糖的积累具有一定的促进作用，当3种无机盐均添加0.15 mg/mL时更加利于多糖物质的积累。以该培养基对红曲霉进行液态发酵，120 h发酵液中胞外多糖的含量可以达到112.3 mg/mL，约为单纯以大米粉为基质进行液态发酵的2倍。
