RP-HPLC测定含银杏叶提取物的注射液中维生素C的含量△

李玉彩，李响明*，周永妍，孙胜斌，姜国志

1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430

银杏叶提取物具有扩张血管、改善微循环的作用。含银杏叶提取物的注射剂主要用于治疗缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、脑栓塞、脑血管痉挛等[1-2]。中药注射剂中往往为了保护主药，而加入维生素C、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等抗氧剂。随着抗氧剂在产品效期内的不断消耗，可能影响到注射剂的安全性、稳定性。因此维生素C用量的确定及在产品有效期内的变化需建立有效的监测控制手段，而这方面的研究相对较少。

维生素C在水溶液中以互变异构的形式存在，性质不稳定，易被光、温度、氧气、金属离子、pH等影响。由于中药注射剂在生产过程中加入惰性气体进行保护，维生素C的降解相对较慢，但在实际测定过程中由于一般不添加惰性气体或抗氧剂，导致维生素C降解较快，这也为维生素C的准确测定增加了难度。《中华人民共和国药典》2015年版采用碘量法[3]测定维生素C的含量，文献已报道过的测定维生素C含量的方法还有滴定分析法[4-6]、苯肼比色法[7]、荧光分析法[8-10]、分光光度法[11]、原子吸收法[12]、高效液相色谱法等[13-15]。因中药注射剂本身颜色的影响，对滴定法终点的判断有干扰；再者中药注射剂中除已知成分和辅料外，还有其他成分，增加了准确测定的难度。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，四元梯度泵；CPA225D电子天平(德国赛多利斯)；SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KH3200E型超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；磷酸、冰醋酸、磷酸二氢钾(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；纯化水；其他试剂均为分析纯。

含银杏叶提取物的注射液为市售产品，如舒血宁注射液、银杏叶提取物注射液。维生素C对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100425-201504)。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节pH值至4～5)(10∶90)为流动相；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；理论板数按维生素C峰计算应不低于8000。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取维生素C对照品适量，置棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液溶解定容，制成每1 mL含维生素C 0.15 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 精密量取市售含银杏叶提取物的注射液1 mL置10 mL棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1检测波长的确定 韩佩莲等[16]选择维生素C最大吸收波长为244 nm，也有研究[17-18]维生素C最大吸收波长选择分别为277 nm和280 nm。本研究中取维生素C对照品适量，制成每1 mL中含维生素C约0.15 mg的溶液，用紫外-可见分光光度计在200～400 nm进行全波长的扫描，结果在波长280 nm处有最大吸收波长，确定其检测波长为280 nm。

图1 维生素C的紫外全波长扫描图

2.2.2 系统适应性及专属性试验 对照品溶液、供试品溶液的高效液相色谱中维生素C理论塔板数分别是15 625、11 243，供试品溶液中维生素C峰分离较好，峰形对称，并且阴性无干扰，该方法专属性良好，见图2～3。

图2 对照品溶液的高效液相色谱图

图3 供试品溶液的高效液相色谱图

2.2.3 线性范围考察 取对照品溶液，分别进样1、2、5、10、20、30 μL测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，得标准曲线。维生素C进样量在0.149 1～4.472 6 μg与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=3 055.5X+63.415，r=0.999 8。

2.2.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，测得峰面积RSD为0.7%。结果表明该方法精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液在室温下避光放置，间隔15 min进样一次，分别于0、15、30、45、60、75 min测定，结果维生素C峰面积RSD为0.6%，表明75 min内稳定。

2.2.6重复性试验 取同一批样品分别平行制备6份供试品溶液，按照拟定的方法测定维生素C含量，测得维生素C含量的RSD为1.02%，表明重复性良好。

2.2.7 回收率试验 取已知含量的样品9份，分别精密加入一定量的维生素C对照品，分别制成低、中、高3个质量浓度的供试品溶液，在上述色谱条件下测定。维生素C的平均回收率为99.65%，RSD为1.12%。

表1 维生素C回收率测定结果(n=9)

2.3 含量测定

取注射液按照前述方法制备供试品溶液，并按拟定方法测定。供试品溶液维生素C峰形对称，部分批次结果见表2。

表2 样品含量测定结果

银杏叶提取物注射液中未检出维生素C，推测处方中未添加维生素C；该厂家说明书成分中无维生素C，与本次测定结果一致。舒血宁注射液中B厂家未检出维生素C，A、C厂家维生素C平均质量浓度0.70 mg·mL-1，说明本检测方法可用于市售银杏叶提取物注射液和舒血宁注射液中维生素C含量的测定。

3 结论

本研究采用普通液相色谱仪、恒定流速洗脱、固定检测波长，建立了测定含银杏叶提取物的注射液中维生素C含量的RP-HPLC方法，结果表明，该方法简单可靠，可作为含银杏叶提取物的注射液中维生素C含量的质量控制方法，样品处理简便，色谱中各成分峰能达到良好的分离效果，测定结果准确，快捷，易于掌握，重复性良好。