中红杨离体叶片植株再生体系建立

孙红英，辛全伟，马志慧，兰思仁b，

（福建农林大学 a.国家菌草工程技术研究中心；b.林学博士后科研流动站；c.林学院，福建 福州 350002）

中红杨（原名中华红叶杨）Populus×euramericana‘zhonghong’是黑杨派杨树2025的芽变品种，2006年获得原国家林业局新品种保护权[1]。中红杨是目前国内唯一的杨树红叶品种,叶面色彩鲜亮明快，颜色三季四变，观赏价值极高，是园林彩叶树种中成景速度最快的良种，在通道绿化、城乡美化 、城区绿化中都具有十分广阔的应用前景，市场潜力巨大[2-3]。中红杨作为绿化树种，以适种区域广、见效快、效益大等优点，深受广大生产者和经营者的青睐[4-5]。然而，随着城市、园林、道路绿化建设力度的加大，优良红叶速生杨苗木紧缺的问题日益突出[5]。通过植物组织培养技术，可以快速繁殖出大量的无菌苗木[6-8]，满足彩叶市场对苗木的需求。此外，通过建立稳定的植物再生体系，为进一步开展转基因研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料的中红杨采自河南商丘，取1年生茎尖作为实验材料，通过组织培养方式获得无菌组培苗， 在培养基MS + 0.3 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1KT上继代培养，培养周期30 d，继代8代后，作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 不同培养基类型对不定芽诱导的影响

将培养30 d的中红杨组培苗在超净工作台上进行操作。以健壮的组培苗为试验材料，将较大的叶片切成4 mm×4 mm的块状，接种到WPM+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；DKW+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 和 MS+0.5 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1NAA 3 种培养基上。将叶片上表面放于培养基表面，观察对比不同培养基类型对红叶杨叶片不定芽诱导的影响，统计不同培养基类型培养的中红杨叶片不定芽诱导率。

1.2.2 不同处理对不定芽诱导的影响

试验采用L9(34)正交实验设计，细胞分裂素6-BA，生长素NAA，蔗糖。6-BA设计为3个浓度梯度：0.1、0.5、1.0 mg·L-1；NAA设计3个梯度浓度为：0.1、0.2、0.3 mg·L-1；蔗糖3个梯度为10、20、30 g·L-1。接种25 d后统计不定芽再生数，计算不定芽再生率（见表1）。

表1 不同处理对不定芽再生影响的正交实验设计L9(34)Table1 Orthogonal design L9(34) of effects of different treatments on adventitious bud regeneration

1.2.3 光照时间对叶片不定芽诱导的影响

将上述操作好的培养基分别培养在0、8、16和24 h·d-1的光照环境条件下，培养30 d，观察统计叶片不定芽诱导的情况。

1.2.4 不定芽的壮苗

将不定芽从诱导的叶片切下，因切下的不定芽比较细弱，通过壮苗途径促使不定芽生长复壮，将不定芽接种于 MS + 0.2 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA的培养基中，培养30 d左右。

1.2.5 中红杨组培苗的生根

将经过壮苗培养后，健壮的组培苗在超净工作台上切成2～3 cm长度，接种于生根培养基1/2 MS + 0.2 mgL-1IBA + 20 g·L-1蔗糖 + 6.5 gL-1琼脂，pH值5.8左右，诱导其生根。

1.2.6 炼苗与移栽

经上述生根后的组培苗放于室外阴凉处3～5 d后开盖喷水保湿，保证叶片舒展，开盖放置3 d左右，将苗从组培瓶中取出，在清水中洗净粘在根上培养基，在5‰的高锰酸钾溶液中消毒30 ～60 s，用清水清洗干净根部残留的高锰酸钾溶液，移栽到大棚或大田中。

1.3 数据分析

愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的叶片数/接种叶片数×100%；不定芽再生率=产生再生芽的叶片数/接种叶片数×100%；叶片平均不定芽数=再生芽总数/产生再生芽的叶片数。试验数据采用SPSS统计分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 基本培养基对不定芽的影响

MS培养基与WPM、DKW培养基对中红杨愈伤组织诱导的差异显著，而在愈伤组织诱导中，培养基WPM和DKW之间的差异不显著（图1 a，P＜0.01），说明在中红杨愈伤组织诱导过程中基本培养基MS优于WPM和DKW培养基。3种基本培养基对中红杨不定芽形成率有较大影响，3种培养基间差异显著，MS、WPM和DKW不定芽诱导率分别是77%、32.33%和13.67%（图1 b，P＜0.001），说明在中红杨不定芽形成过程中，基本培养基MS优于WPM和DKW培养基。基本培养基MS的平均出芽数为3.6个，WPM培养基的平均出芽数是1.3个，DKW培养基的出芽数是0.5个（图1 c,P＜0.001），说明在中红杨平均出芽数方面，基本培养基MS优于其它两种基本培养基。

2.2 不同浓度6-BA、NAA和蔗糖对不定芽诱导的影响

从表2分析出，不同激素对中红杨叶片不定芽诱导都有较大影响，通过极差分析，在中红杨叶片不定芽诱导的过程中，6-BA、NAA和蔗糖对不定芽诱导的影响从大到小的顺序是：6-BA ＞NAA ＞ 蔗糖。从所设6-BA 3个梯度浓度所得到K值38、59.7、42.3，中红杨叶片诱导不定芽不是随着6-BA的浓度增加而增加。从正交实验中得出，中红杨不定芽诱导最优的培养基为：MS + 0.5 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-11 NAA + 30 g·L-1蔗糖。

图1 培养基对不定芽再生的影响Fig.1 Effect of medium types on adventitious bud regeneration

表2 不同浓度6-BA、NAA和蔗糖对不定芽诱导的影响Table2 Effects of 6-BA, NAA and sugar with different concentrations on adventitious bud regeneration

方差分析（表3）表明，在中红杨叶片诱导不定芽的过程中，细胞分裂素6-BA对不定芽诱导影响最大，其F值为177.769，在0.01水平达到显著。其次，对中红杨诱导不定芽影响大的NAA，其F值21.308，在0.05水平达到显著。蔗糖对中红杨诱导不定芽的影响不显著。

表3 不同质量浓度6-BA、NAA和蔗糖对不定芽诱导影响的方差分析Table3 Variance analysis on effects of 6-BA, NAA and sugar with different concentrations on adventitious bud regeneration

2.3 光照条件对不定芽再生的影响

在愈伤组织诱导过程中，暗培养和光照8 h·d-1处理间无显著差异（图2 a,P＞ 0.05），有利于诱导愈伤组织，光照16 h·d-1和24 h·d-1处理间也无显著差异（图2 a,P＞ 0.05），但不利于愈伤组织的诱导。在光照对中红杨不定芽诱导有显著差异，光照16 h·d-1不定芽诱导率最高75%，光照8 h·d-152%，而光照 0 h·d-1和 24 h·d-1不定芽诱导率分别是17%，31.7%（图2 b,P＜0.001）。

2.4 中红杨不定芽再生及壮苗生根

叶片接种10 d后，叶片卷曲，叶片边缘有颗粒状愈伤组织形成，接触培养基的部分开始有绿色芽点长出，小部分已经形成芽，并逐渐形成丛生芽（图3 a）。接种20 d后，叶片形成较大的愈伤组织，形成芽点处为翠绿色，无芽点形成的地方褐色甚至微黑色，形成的芽约0.5 ～ 1.0 cm（图3 b）。30 d后，将形成约0.5～1.0 cm的芽切下，接种到壮苗培养基中壮苗，培养30 d（图3 c）。经过壮苗，苗长至2 ～ 3 cm，切下接种到生根培养基中，诱导生根（图3 d）。

图2 光照条件对不定芽再生的影响Fig.2 Effects of light conditions on regeneration of adventitious buds

图3 中红杨叶片直接诱导不定芽与植株再生Fig.3 Direct induct adventitious bud and regeneration of adventitious buds of Populus × euramericana ‘zhonghong’

3 结论与讨论

中红杨不定芽诱导过程中，MS培养基有利于中红杨的不定芽诱导，MS基本培养基愈伤组织诱导率较高，不定芽形成个数较多。6-BA对不定芽诱导有较大影响，添加适量的6-BA有利于不定芽的形成。然而，低浓度6-BA不利于不定芽的形成，高浓度的6-BA虽然能形成较多的不定芽，但有效芽数较少，这是由于高浓度的6-BA导致不定芽玻璃化[9]，减少了有效芽数。生长素NAA有利于不定芽诱导，最佳诱导浓度并不是随着NAA浓度的升高而升高，这与生长素的特性相关，低浓度促进生长，高浓度抑制生长[9]。外源添加蔗糖对不定芽的诱导影响不大，与潘梅等[10]的研究结果一致。光照对不定芽的形成有一定影响，暗培养有利于形成愈伤组织，但不利于不定芽的形成，全光照培养不利于愈伤组织的形成，有利于不定芽的诱导[11]。中红杨诱导不定芽最佳光照条件为每天16 h光照 + 8 h暗处理。在中红杨不定芽诱导过程中，虽然不定芽数量较多，但高度较低，必须通过壮苗才可以达到生根要求，这与前人的研究结果相同[12]。综上，本试验直接从中红杨叶片直接再生不定芽，省掉了诱导愈伤组织阶段，获得了较高的不定芽诱导率，为工厂化育苗奠定了理论基础。下一步，我们将在较高不定芽诱导率的前提下，改良培养基配方，促进不定芽的伸长，提高生根有效苗数，减少生产中的壮苗阶段，进而降低生产成本，为工厂化育苗提高良好的技术基础。进一步，结合转基因技术，将抗虫基因转入中红杨，提高中红杨的抗虫性。