中药蒲黄对急性脊髓损伤大鼠模型伤后行为能力的影响

孔 亮，朱文潇，刘 蓓，王向阳，韩 志，杨 磊，曹向阳，崔宏勋

脊髓损伤是一种引起损伤平面以下运动感觉功能一定程度丧失的神经性疾病。目前缺乏特效的治疗手段，临床上广泛采用的是伤后早期手术减压、甲强龙激素冲击疗法、物理治疗等[1-3]。有研究表明，香蒲科植物蒲黄对脊髓损伤具有一定的神经保护作用[4-5]。本研究探讨中药蒲黄对急性脊髓损伤大鼠模型神经功能恢复的影响，旨在为脊髓损伤的药物治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只SPF级雌性SD大鼠[许可证号：SCXK（湘）2016-0002；批号：43004700056215]，5周龄，体质量（235±15）g，购自湖南莱克斯景达实验动物有限公司。将所有大鼠置于室温22℃～24℃、湿度50%～60%的自然光照环境中，进食饮水自由。

1.2 实验方法

1.2.1 建立急性脊髓损伤模型 采用Allen's法。首先配置体积分数为10%的水合氯醛溶液，以300 mg/kg的剂量进行腹腔注射。麻醉成功后碘伏消毒，于胸背部正中显露T9～T12椎板，行T10～T11全椎板、T9和T12邻近椎板切除，暴露硬脊膜，以钳夹固定T9和T12棘突。将底部为凹面的塑料垫片覆盖于T10～T11硬脊膜上，以避免二次损伤。取一10 g不锈钢棒，从高10 cm处自由落下，击打在所覆盖的垫片上，造成大鼠急性脊髓损伤。若击打后大鼠出现迅速摇尾反应，双后肢及躯体回缩扑动，表明撞击成功；观察术后相应节段脊髓，均表现出明显的瘀血及水肿（图1）。冲洗伤口并依次缝合硬脊膜、椎旁肌肉、筋膜和皮肤。肌注青霉素钠10万U（2次/d，3 d）以避免感染。术后大鼠单笼饲养于相同环境中，术后4 h通过按摩膀胱行辅助排尿，此后每天辅助排尿2次，直到重新建立膀胱反射。

1.2.2 分组处理 随机选取10只大鼠仅行椎板切除而不损伤脊髓，作为A组。其余40只造模成功的大鼠经计算机随机分为B、C、D、E组，每组10只。造模成功后即开始灌胃，1次/d，维持5周，其中A、B组给予生理盐水，C、D、E组分别按照1、5、10 g/kg的剂量标准给予蒲黄水煎液灌胃。

图1 大鼠脊髓损伤造模后脊髓T10～T11节段呈明显瘀血水肿

具体药物配制方法：以白细布将生蒲黄（产地江苏，由河南省洛阳正骨医院药剂科提供）按照低剂量（1 g/kg）、中剂量（5 g/kg）、高剂量（10 g/kg）包好，分别加蒸馏水100 mL文火煎煮30 min，留滤液，重复2次，将滤液混合后置于量杯中，加水稀释至20 mL。在pH计（英国Jenway公司3510型）监测下缓慢加入0.1 mol/L NaOH溶液，调整pH值至7～8后冷藏备用。

1.3 观察指标

将大鼠放入便于观察的容器中，敲击侧壁，使其爬行，观察髋、膝、踝3处关节活动状况。按照Basso Beattie Bresnahan（BBB）评分[6]评估大鼠脊髓损伤后运动功能，0～7分为单一关节小幅度运动或无负重状态下爪面朝地，8～13分为后肢不协调运动，14～21分为移动时前后肢具有一定协调性。造模成功后1 d开始进行首次评价，此后每周评价1次，持续5周。每次评价均由2名掌握BBB评分方法但未了解实验目的及分组方法的研究人员完成，取平均分为最终分值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，同一时相点各组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，每组造模后不同时相点比较采用重复测量的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

造模后1～7 d，B、C、D、E组均未发现任何下肢活动；14 d观察到D、E组大鼠后肢出现轻微活动，D、E两组BBB评分分别与A、B 2组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；造模后21 d，C组出现后肢轻微活动，D、E两组活动能力进一步提高；造模后28 d，B组开始出现关节轻微活动，D、E两组关节功能恢复较好，且E组可在非承重情况下爪面着地；造模后35 d，B、C两组评分差异并无统计学意义（P＞0.05），C组运动情况未得到明显改观。D组、E组肢体功能进一步改善，偶见D组非承重状态下爪面着地，E组出现后肢协调运动（P＜0.05）。造模后不同时相点各组BBB评分见表1。

3 讨论

3.1 脊髓损伤后的继发性损伤机制

Merli等[7]指出，创伤后机体于72 h内达到高凝状态，并维持7～10 d。这种高凝状态很可能导致神经组织细胞缺血性改变，阻碍神经细胞修复，引发细胞自噬、炎症反应等机制[8-9]，以致于更大范围的神经变性坏死，引起损害更重、影响更深远的继发性损伤反应，进而导致脊髓损伤区域同侧肢体的运动障碍，严重影响机体的自主行为活动。

Yick等[10]的实验结果显示，C3及T1、T11的半横断损伤均可导致Clarker核神经元的异常死亡，引起脊髓小脑束继发性损伤；其中T1和T11损伤导致L1节段在5～10 d时最先出现Clarke核神经元死亡，损伤20 d后这一状况会逐渐减缓，至伤后40 d左右，脊髓小脑束继发性损伤终止。故本研究设计建立大鼠T10～T11脊髓横断损伤模型，并将观察周期限定在40 d以内，在这一时间范围内测定的BBB评分在一定程度上可被认为是观察对象的结局。

表1 蒲黄溶液处理组与对照组脊髓损伤模型大鼠造模后BBB评分比较（±s，n=10，分）

表1 蒲黄溶液处理组与对照组脊髓损伤模型大鼠造模后BBB评分比较（±s，n=10，分）

注：BBB评分：Basso Beattie Bresnahan评分；*：与A组比较，P ＜0.05；#：与B组比较，P ＜0.05A组：假手术对照组；B组：生理盐水对照组；C组：低剂量组；D组：中剂量组；E组：高剂量组

组别A组B组C组D组E组1 d 17.4±0.5 0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*7 d 20.6±0.8 0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*14 d 21.0±0.6 0.0±0.0*0.0±0.0*1.0±0.9*#0.6±0.5*#21 d 21.0±0.6 0.0±0.0*1.4±0.5*#3.4±1.4*#3.4±1.0*#28 d 21.0±0.6 0.4±0.5*2.4±0.5*5.0±1.8*#7.4±3.0*#35 d 21.0±0.6 0.4±0.5*3.0±0.6*6.6±1.4*#9.4±3.6*#F值29.794 0.487 5.905 51.501 34.120 P值0.001 0.781 0.003 0.001 0.001

3.2 蒲黄的药物作用及其治疗脊髓伤后继发性损伤的机制

传统中药蒲黄具有止血和消肿化瘀的功效，近年来有研究证实，炮制后的蒲黄炭可明显缩短小鼠活化部分凝血活酶时间（activated partial prothrombin time，APTT），而生蒲黄则可显著延长小鼠APTT，大剂量下可促进纤维蛋白溶解[11]，改善脊髓损伤导致的机体高凝状态，为神经细胞的修复清除障碍。此外，Wang等[4]还发现中药蒲黄可有效降低脊髓损伤组织中LC3、Beclin-1、mTOR和Akt的蛋白浓度，从而抑制细胞的自噬和免疫反应。

3.3 炮制工艺对蒲黄药物作用的影响

作为传统中药，蒲黄最初仅以生蒲黄直接入药和焙至微黄服用2种方法，后又出现蒲黄炭的炮制工艺[12]。周习等[13]通过色谱法和动物实验发现生蒲黄相较于蒲黄炭具有更优的活血作用，可明显改善血液循环。本研究采用的蒲黄水煎液是以生蒲黄的传统炮制方法制备，能够最大限度地发挥蒲黄的抗凝作用，加速脊髓损伤及其邻近区域的血液微循环，促进大鼠模型的伤后恢复。

3.4 蒲黄对急性脊髓损伤大鼠模型伤后行为能力的影响

本实验中大鼠在脊髓损伤造模后均失去后肢活动能力，而中、高剂量组大鼠在2周后率先出现后肢关节的轻微活动，低剂量组在3周后也出现该迹象，生理盐水对照组4周时方有轻微的后肢活动。损伤后第5周，高剂量组中部分个体可进行后肢掌面的承重活动，中剂量组中最好者可达到非承重状态下的掌面触地，两组均明显优于仅一两个关节可轻微活动的生理盐水对照组。而低剂量组整体结果与生理盐水对照组间的差异虽不显著，但个别大鼠可恢复至三个关节的轻微活动。在王卫国等[14]的研究中，使用低剂量蒲黄的试验组第五周即发现与对照组存在显著性差异。而本研究中C组与生理盐水对照组差异始终无统计学意义，推测可能是由于给药方式不同，灌胃相比于腹腔注射更贴近于患者实际使用场景，后期应进行更大样本试验或针对蒲黄的吸收机制进行探究。总之，注射蒲黄实验组大鼠在起始恢复时间和最终功能评价方面均优于生理盐水对照组，且随剂量升高，表现更佳，二者与蒲黄注射液的浓度亦可能存在正相关关系，这些结果提示，中药蒲黄在促进脊髓功能恢复和阻止脊髓损伤范围扩大方面可能起到显著的治疗作用。

3.5 不足之处

脊髓损伤的恢复涉及凝血机制、细胞自噬机制、免疫机制等[15-17]，仅凝血机制尚不能完全解释脊髓恢复的全过程；而在实验后期，大鼠行为能力的恢复受康复运动因素正反馈作用的影响[18]，其作用大小尚未可知，可能会对结果造成一定偏倚；本研究亦未考虑不同产地来源的蒲黄有效成分可能存在差异以及大鼠样本量带来的偏倚。总之，本次研究从动物实验角度初步论证蒲黄对于急性脊髓损伤的治疗作用，为脊髓损伤的药物治疗选择提供基础研究依据。