运用有效的预处理方式改进菊科植物染色体标本制备技术

张楠卿

据了解， 菊科植物约1000属，25000-30000种，广布全世界，热带较少。我国约233属，近3000种。本科植物花两性或单性，稀单性异株，整齐或左右对称。种子无胚乳，具2、稀1枚子叶。本科种类繁多，许多种类富有经济价值，良好的药用价值，菊科的一个主要特征是菊糖完全代替了淀粉作为多聚糖贮存。菊科所含有的倍半萜内酯类具有强心、抗癌、驱虫、镇痛等作用。本科中有350余种倍半萜内酯。地胆草属某些种含苦地胆苦素和异苦地胆苦素。这些成分均有抑制肿瘤生长的作用。值得我们去研究。

此次选取菊科植物中的百日草为例子。

首先是材料的处理过程：

1.前处理 活体根系的处理，发芽材料的根系在不同的处理液中浸泡，此处选取秋水仙素浓度0.01%于8-16℃处理10-24小时，了解到，低温处理有利于染色体缩短和获得多的中期分裂相。

2.固定   将前处理材料取出，进行自来水清晰，再用固定液进行处理24小时，植物材料的固定可用酒精和醋酸混液作固定剂。卡诺或FAA等真空材料使其快速渗透（针筒抽气直到材料下沉）。一般组织切片使用FAA固定液。

3.材料保存 所用材料经过固定，必须经过清洗。用水配置的固定液多用水洗，用酒精配置的多用浓度相同或者稍低浓度的酒精洗涤，后置于FAA液体中保存。

4.离析压片 细胞离析观察，可用1N的盐酸（10%）在60℃的水浴处理五分钟到十五分钟，我们实验中处理了大约十分钟，如果时间过长，不易染色，时间不足的话细胞不易分开。离析后用水冲洗盐酸直到干净，后使用染色剂染色。

染色体的压片，将洗净的根尖放于培养皿中，加入染剂染色（卡宝品红）几小时，将根尖放在载玻片上，滴一滴45%醋酸溶液，迅速捣碎根尖，盖上玻片，进行挤压，用橡皮头轻轻捣，并且用火輕烤。

5.镜检 压片后进行镜检，把符合的玻片装置进行标记，并且在冰箱之中冻结，取下盖玻片，采用50%酒精—70%酒精—95%酒精—无水酒精+二甲苯，封片。

植物制片中的染色类型：

（1） 番红-圆绿对染法

叶组织切片最常用的染色方法，染色结果是染成红色，薄而具纤管地物的限方真纤增素的细胞壁及细质染成绿色。

2） 铁矾苏木精法  细胞质染成浅灰色或植物细胞学及胚胎学制片上应用细胞分裂时期的染色体染成监果色，要染色效果在4-6无色。用0.59%苏木精水溶液。木精粉末在水中完全解约需1周左右1周达到最好：放3-6 个月后实效。

细胞分裂制片的染色。材料最好用银酸

（3）  番红-结晶紫-橘红G三重染色酸和铬酸固定。

染色体染成红色、染色质紫色、核仁淡红色、纺锤丝紫色、细胞质淡黄灰色。

4） 鞣酸-三氧化铁法

植物分生组织-生长性制片。薄壁组织的细胞壁染成黑色或深蓝色，细胞质灰色，细胞核红色

（5）高碘酸-席夫（PAS） 反应法

高等植物纤维素细胞壁及淀粉粒的染色。可将纤维素细胞壁及储藏淀粉染色鲜红色。

染色体制片按Song的方法。当生长旺盛的供试材料根长23cm时，取2mm长的根尖放入饱和a-澳蔡溶液25"C处理4hr，去离子水充分洗净后用新鲜甲醇和冰乙酸混合液（3： 1）

固定3-24hr，水洗后置2%纤维素酶（Sigma）和2%果胶酶（SERVA） 溶液中，28°C条件

下酶解约1.5hr. 水洗并固定后采用火焰干燥法制片，-20°C保存备用。

（6）染料的配方：醋酸-洋红法

配制： SOml的45%醋酸水溶液在锥形瓶中煮沸，徐徐投入0.5g洋红粉末。煮1-2min放一铁钉Imin，或加入醋酸铁溶液1-2滴，过滤后保存于棕色瓶中。

植物染色体组的观察：

（1）取材 观察有丝分裂材料：材料可用根尖，茎端等等，种子萌发的根尖长约1-2mm合适，种子大的可以取侧根，栽培植物的根尖则应取新的萌发幼根。

观察减数分裂材料选择幼小花芽，取材时间应进行不同时间阶段的处理，间隔一个半小时左右，根尖取三厘左右，茎或花蕾进行材料切割，分成3—4mm大小块组织。

（2）预处理 植物进行有丝分裂时，染色体形状细长，交织在一起不利于观察，需要进行前处理，目的在于阻碍纺锤丝的形成，促使染色体收缩变短。

首先，用100ml蒸馏水加入一滴a-溴萘，充分振荡，配成饱和水溶液。

其次，100ml的对二氯苯饱和溶液中加入一滴a-溴萘，充分振荡，大染色体材料处理2—12hr，真空处理使其快速渗透。

（3）固定   植物材料的固定可以用酒精和醋酸混液作固定剂，进行真空处理使其快速渗透，一般组织切片用FAA作固定液。

（4）离析压片 细胞离析观察，可用1N的盐酸（10%）在60℃的水浴处理五分钟到十五分钟，我们实验中处理了大约十分钟，如果时间过长，不易染色，时间不足的话细胞不易分开。离析后鼻音用水冲洗盐酸直到干净，后使用染色剂染色。

染色体的压片，将洗净的根尖放于培养皿中，加入染剂染色（卡宝品红）几小时，将根尖放在载玻片上，滴一滴45%醋酸溶液，迅速捣碎根尖，盖上玻片，进行挤压，用橡皮头轻轻捣，并且用火轻烤。

5.镜检 压片后进行镜检，把符合的玻片装置进行标记，并且在冰箱之中冻结，取下盖玻片，采用50%酒精—70%酒精—95%酒精—无水酒精+二甲苯，封片。

经过试验证明，通过有效的预处理方式可以有效的菊科植物染色体标本制备技术，这种方法一定程度上可以让观察者更好的观察到菊科植物染色体的分布排列情况，可以很好的服务于后期的药用价值研究。