桑椹醇提物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究

廖素凤，刘鑫义，刘江洪,，杨志坚，郑金贵*

1福建农林大学 福建省作物生物技术高校重点实验室；2福建农林大学 作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室；3福建农林大学 福建省特种作物育种与利用工程技术研究中心，福州 350002

亚硝胺和亚硝酸盐是环境中最常见的化学致癌物，在食物、饮料、烟草、化妆品和工业污染中普遍存在[1]。流行病学调查表明，消化道癌症频发与机体内的亚硝胺类物质有直接关系[2]。亚硝酸盐是亚硝胺类化合物的前体物质，在胃液环境中极易通过亚硝化反应合成N-亚硝胺[3]。因此，研究清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的有效物质对于预防和控制相关癌症的发生具有重要意义。

目前关于多酚和黄酮类物质等植物化学物质清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的研究已有较多报道[4-6]。赵岩等[7]比较了38种药用植物醇提物对亚硝酸盐的清除作用，发现小花地笋、茜草和野生葡萄(籽)等醇提取物具有较强的清除亚硝酸盐的作用，且与总酚含量呈正向相关。范金波等[8]研究发现，桑椹提取物总酚和黄酮含量较蓝莓和黑加仑多，其抗氧化能力也均强于蓝莓和黑加仑，提示桑椹总酚、黄酮含量与其抗氧化活性相关。综上所述，食用富含多酚类和黄酮类等活性物质的各种新鲜水果、蔬菜等天然植物，可以一定程度地清除亚硝酸盐或阻断亚硝胺的合成。

桑椹(FructusMori)是桑科桑属植物的成熟果穗，为卫生部首批公布的“药食同源”食品之一[9]。我国收集保存的3 000多个桑树种质资源分属于15个桑种4个变种[10]，是世界上桑椹资源最多的国家。近年来研究结果表明，桑椹除含有丰富的氨基酸、维生素、矿物质外，还含有黄酮、多酚、白藜芦醇和原花青素等活性成分[11,12]，具有抗氧化、抗肿瘤、降糖降脂和改善心血管功能等药理作用[12,13]。

目前对多酚类、黄酮类化合物和原花青素抑制亚硝化反应的作用研究虽然较多，但其均为对特定品种植物的研究，不具有代表性，尚未发现有关桑椹活性物质清除亚硝酸盐和阻断二乙基亚硝胺(NDEA)合成作用的系统报道。本文拟采用超声辅助乙醇浸提的方法提取桑椹活性物质，在体外模拟胃液条件下探讨桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除和对NDEA合成的影响，同时分析不同桑椹试样原花青素、总黄酮和总酚含量与清除亚硝酸盐、阻断NDEA合成作用的相关性，为研究桑椹在预防亚硝胺致癌方面的应用价值和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 桑椹样品

辽宁大连黑果桑、山东青岛黑果桑和北京大兴黑果桑鲜果(一级),购自福州海峡果品批发交易市场；台湾四季果桑46C016、台湾四季果桑72C002、PR-01黑果桑、白珍珠果桑、AH-07果桑、野生蒙桑和推广品种栽培蒙桑，采自福建农林大学农产品品质研究所桑树种质资源圃(永泰基地)，采摘时间为2017年4～5月；安徽野生桑椹冷冻果、百草味桑椹干(果脯类)购于淘宝网店；新疆和田野生药桑干、北京普济仁堂桑椹干和安徽集泽堂桑椹干购于市场药店。上述桑椹鲜果均于采收后立即清洗，冷冻干燥后粉碎过60目筛，-80 ℃保存备用。

1.2 实验试剂

NDEA(纯度>99.9%，0.1 g)、亚硝酸钠(纯度为99.999%，25 g)、没食子酸(纯度≥98%)、抗坏血酸(VC,纯度≥98%)和原花青素标准品(纯度≥98%,HPLC)均购自Sigma公司；芦丁对照品(纯度≥92.5%)，购于中国药品生物制品检定所；Folin-Phenol试剂，购于索来宝有限公司；乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司产品；甲醇、乙醇、碳酸钠、柠檬酸、盐酸、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺和香草醛等试剂，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 仪器

日立L-2000高效液相色谱仪(Hitachi公司，日本)，D-2000 Elite HPLC System(Hitachi 公司，日本)，Waters SunFire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，2.5 μm，Waters公司，美国)，Infinite M200 TECAN酶标仪(TECAN公司，瑞士)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超市仪器有限公司，中国)，3K-15型高速冷冻离心机(Sigma公司，德国)，美国Milli-Q Reference型超纯水仪(厦门精艺兴业科技有限公司，中国)，ALPHA 1-2LD PLUS 冻干机(Marin Christ公司，德国)。

2 实验方法

2.1 桑椹醇提物的制备

采用乙醇为溶剂超声辅助提取桑椹活性物质[14]：称取桑椹粉末3.00 g，按料液比1∶25(g∶mL)加入75%乙醇(v/v)75 mL，在超声功率200 W、35 ℃条件下提取30 min，重复提取3次，合并提取液，过滤除渣，滤液减压浓缩后定容，测定原花青素、总酚和总黄酮含量，剩余提取液浓缩冻干，得提取物冻干粉，-80 ℃保存备用。

2.2 桑椹醇提液总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteus法测定总酚含量[15]，稍加修改。以没食子酸质量浓度(x，单位μg/mL)为横坐标，吸光度(y，单位A)为纵坐标，制作标准曲线y=0.007 5x-0.012 5(R2=0.999 4)。取样品醇提液1 mL，按照绘制标准曲线的方法，于波长760 nm下测定吸光度。以上操作重复3次。根据回归方程和下式计算样品中总酚含量(以没食子酸计)。

总酚含量(mg/g) =c× V × 25 × 10-3/(m ×V1)

式中：c为比色管中样品总酚浓度(μg/mL)，V1为反应体系中样品提取液体积(mL)，V为样品提取液总体积(mL)，m为用于提取的干粉质量(g)。

2.3 桑椹醇提液原花青素含量的测定

采用香草醛-盐酸法[12]测定原花青素含量。以吸光度(y，单位A)为纵坐标，原花青素质量浓度(x，单位mg/mL)为横坐标，制作标准曲线y=0.842 2x-0.008 5(R2=0.999 1)。取稀释后的样品醇提液各1 mL，按照绘制标准曲线方法，于波长500 nm处测定吸光度。以上操作重复3次。根据原花青素标准曲线和下式计算样品中原花青素含量(以原花青素计)。

原花青素含量(mg/g)=c×V1×X×V/(m×V2)

式中:c为反应液中原花青素的浓度(mg/mL)，V1为反应液的总体积(6 mL)，X为提取液稀释的倍数，V为待测提取液的总体积(mL)，m为用于提取的干物质重量(g)，V2为反应液中稀释后的待测提取液体积(1 mL)。

2.4 桑椹醇提物总黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al (Cl)3法测定总黄酮含量[16]。以吸光度(y，单位A)为纵坐标，芦丁质量浓度(x，单位mg/mL)为横坐标，制作标准曲线y=12.633x-0.033 6(R2=0.999 1)。取各样品醇提液0.5 mL，按照绘制标准曲线的方法，于波长510 nm处测定吸光度。以上操作重复3次。

总黄酮含量(mg/g)=c×V1×V/(m×V2)

式中:c为反应液中总黄酮浓度(mg/mL)，V1为反应液的总体积(25 mL)，V为待测提取液的总体积(mL)，m为用于提取的干物质重量(g)，V2为反应液中加入的测提取液体积(0.5 mL)。

2.5 桑椹醇提物对亚硝化反应的抑制作用

2.5.1 桑椹醇提物浓度对亚硝酸盐清除率的影响

将PR-01黑果桑醇提物冻干粉配置成2 mg/mL的样品溶液(含有1.49 mg/mL原花青素)，分别吸取一定体积的上述样品溶液用蒸馏水配成0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的待测液(相当于原花青素浓度为6、15、30、59、119、178、238、297 μg/mL)。

在体外模拟胃液条件下(pH3.0，37 ℃)，采用盐酸萘乙二胺法[7]测定不同桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率。在25mL容量瓶中准确吸取不同浓度的桑椹醇提物待测液各1 mL，参照赵岩等[7]的反应方法，以不加桑椹醇提物待测液的反应液做空白，在540 nm处测定吸光值。用VC做对照实验。每个样品重复检测3次，用下式计算清除率：

式中：A0为不加桑椹醇提物待测液的反应液的吸光度，A1为加入桑椹醇提物的反应液的吸光度。

2.5.2 反应时间对桑椹醇提物清除亚硝酸盐的影响

固定桑椹醇提物待测液浓度为0.8 mg/mL，按2.5.1方法研究不同反应时间(0、10、20、30、40、50、60、70、80 min)对桑椹醇提物清除亚硝酸盐的影响。用VC做对照实验。

不同桑椹样品醇提物对亚硝酸盐的清除作用采用上述筛选的最佳醇提物浓度和反应时间进行清除反应，并比较清除率。

2.5.3 二乙基亚硝胺标准曲线的制作

采用HPLC法检测NDEA[17]。利用日立L-2000高效液相色谱仪的D-2000 Elite HPLC System，吸收波长230 nm，Waters SunFire C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，2.5 μm)，流速0.5 mL/min，进样量20 μL，流动相：甲醇/水=50 / 50 (体积比)，柱温30 ℃。用蒸馏水配制0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、40、60、80、100 μg/mL的NDEA标准溶液，0.22 μm滤膜过滤后进行液相色谱测定。以NDEA 质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制NDEA的标准曲线。根据标准曲线计算样品和空白样反应体系中NDEA的生成量，再根据公式计算桑椹醇提物对NDEA合成的阻断率。

式中C和C0分别为样品和空白样反应体系中NDEA的生成量(μg)。

2.5.4 模拟人体胃液条件下桑椹醇提物对NDEA合成阻断率的测定

在各试管中加入0.1 mol/L柠檬酸0.8 mL、1 mol/L二乙胺 0.1 mL和100 mmol/L亚硝酸钠 0.1 mL，混合，分别加入2.5.1配制的不同浓度的桑椹醇提物溶液1 mL，涡旋混合调节pH至3.0。在37 ℃条件下反应4 h后，再加入0.1 mL的1%对氨基苯磺酸混匀终止反应。用VC做对照实验。按2.5.3的方法进行液相色谱测定和计算阻断率。不同样品桑椹醇提物对NDEA合成的阻断实验采用上述筛选的最佳醇提物浓度进行比较。每个样品重复检测3次。

2.6 桑椹醇提物清除亚硝酸盐、阻断NDEA合成的能力与其原花青素、总酚和总黄酮含量的相关性分析

本研究应用简单的线性回归分析15个不同桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率、对NDEA合成的阻断率及其与醇提物中总酚、总黄酮含量之间的相关性。

2.7 数据分析

3 结果与分析

3.1 不同试样桑椹醇提物中原花青素、总酚和总黄酮的含量

表1 15个桑椹试样的原花青素、总酚和总黄酮含量

注：同一指标中不同上标小写字母表示样品间差异达显著水平 (P<0.05)，大写字母不同，表示组间差异达极显著水平 (P<0.01)。下同。

Note:Different superscript lowercase letters in the same index indicated a significant difference between the samples (P<0.05);Different superscript capital letters in the same index indicated a very significant difference between the samples (P<0.01).Same as below.

从表1可知，15种试样桑椹醇提物的原花青素、总酚和总黄酮含量存在显著差异，范围分别为2.36±0.07 ～ 155.41±3.34 mg/g(以原花青素计，干基)、0.79±0.18 ～11.86±0.15 mg/g(以没食子酸计，干基)和0.31±0.08 ～ 3.05±0.11 mg/g(以芦丁计，干基)，桑椹鲜果冻干粉的醇提物中上述活性成分含量普遍高于市售桑椹干的。另外，同一季节不同产地(辽宁大连、山东青岛和北京大兴)的黑果桑原花青素和总黄酮含量存在显著差异，不同桑椹原花青素、总酚和总黄酮含量也存在显著差异，其中，引进的PR-01黑果桑的总黄酮和原花青素含量均最高，分别为3.05±0.11、155.41±3.34 mg/g，是推广品种栽培蒙桑的7.44倍和2.90倍，多酚含量最高的品种是野生蒙桑，为11.86±0.15 mg/g，是栽培蒙桑的2.52倍，而百草味桑椹干的3个活性成分含量均最低。

此外，本文还分析了PR-01黑果桑醇提物冻干粉的总酚类、总黄酮和原花青素含量。测定结果显示，PR-01醇提物冻干粉中总酚类、总黄酮和原花青素含量分别为187.25±6.35 mg/g (以没食子酸计)、79.01±4.78 mg/g(以芦丁计)和297.12±3.34 mg/g(以原花青素计)，其中原花青素含量较高，黄酮含量相对较低。

3.2 模拟胃液条件下桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除效果

3.2.1 不同桑椹醇提物浓度对亚硝酸盐清除能力的影响

如图1所示，随着浓度的增大，桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率快速提高，增加到一定浓度后，清除率的增幅减缓，并趋于平稳。当桑椹醇提物浓度为0.8 mg/mL(其原花青素浓度为238 μg/mL)时，对25 μg NaNO2的清除率最高达92.07%，仅略微低于同等条件下维生素C的清除能力(95.67%)，表明桑椹醇提物对亚硝酸盐具有较强的清除能力。因此，后续实验选用0.8 mg/mL桑椹醇提物进行不同试样桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除实验。

3.2.2 不同作用时间下桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率的影响

由图2可知，在模拟胃液条件(pH值 = 3，T=37 ℃)下，当作用时间从0 min增加至60 min时，浓度为0.8 mg/mL的桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率明显上升，增加至60 min时清除率升至最高(86.16%)，继续增加作用时间，清除率基本保持不变，说明在一定时间内桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率与作用时间呈正相关，超出一定时间范围清除率保持不变，所以后续实验选用60 min作为反应时间。

图1 模拟胃酸条件下不同桑椹醇提物浓度对亚硝酸盐清除能力的影响Fig.1 The effect of different concentration of mulberry alcohol extract on nitrite scavenging rate under simulated gastric juice

图2 模拟胃液条件下不同反应时间对桑椹醇提物清除亚硝酸盐的影响Fig.2 The effect of different reaction time on nitrite scavenging rate with mulberry alcohol extracts under simulated gastric juice

3.2.3 不同桑椹试样对亚硝酸盐的清除率比较

由表2可知，控制桑椹醇提物的原花青素质量浓度相同时(238 μg/mL)，15种桑椹试样醇提物对亚硝酸盐均具有一定的清除作用，但不同样品的清除能力存在较大差异，其中PR-01黑果桑、山东青岛黑果桑和野生蒙桑的醇提物对亚硝酸盐的清除率均大于80.00%，显示出很强的亚硝酸盐清除作用；辽宁大连黑果桑、台湾四季果桑46C016、AH-07黑果桑和安徽野生桑椹冷冻果的醇提物对亚硝酸盐清除率大于50.00%，也具有较强的亚硝酸钠清除能力。另外，冻干的桑椹鲜果普遍优于市场上的桑椹干，其中PR-01黑果桑的清除率最高，达92.25%，而百草味桑椹干的清除率最低，两者相差19.38倍。

表2 15种桑椹试样醇提物的亚硝酸盐清除率和NDEA合成阻断率

3.3 模拟胃酸条件下桑椹醇提物对二乙基亚硝胺形成的影响

3.3.1 二乙基亚硝胺的检测

如图3A所示，NDEA标样的色谱峰尖锐，峰形对称，基本无拖尾现象，分离效果较好。样品的典型色谱图见图3B，图中所示的是0.05 mg/mL桑椹醇提物对NDEA生成的作用。NDEA峰型对称，分离效果好，与标准品的保留时间一致。以NDEA质量浓度( μg/mL) 为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。当NDEA浓度为0～100 μg/mL时，回归方程为y=2 713.5x+ 93.792，R2=0.999 2，说明有很好的线性关系。

图3 二乙基亚硝胺(NDEA)的色谱图Fig.3 The chromatogram of N-nitrosodiethylamine (NDEA)

图4 模拟胃液条件下不同桑椹醇提物浓度对NDEA合成阻断率Fig.4 The effect of different concentration of mulberry alcohol extract on blacking rates of NDEA synthesis under simulated gastric juice

3.3.2 桑椹醇提物浓度对NDEA合成的阻断效果的影响

由图4可见，在0～0.6 mg/mL范围内，随着质量浓度的增加，桑椹醇提物对NDEA合成的阻断率逐渐提高，浓度大于0.6 mg/mL后，阻断率趋于饱和，变化较小(84.01%～87.94%)。同时，在0～0.4 mg/mL范围内，随着VC浓度的增加，对NDEA合成的阻断率快速提高至91.58%，继续增加Vc质量浓度，二乙基亚硝胺的生成几乎被完全抑制。本研究中桑椹醇提物和Vc对NDEA合成的阻断能力的IC50值分别为36 μg/mL和33 μg/mL。结果表明，桑椹醇提物对NDEA合成的抑制作用趋势与Vc基本一致，同等条件下其阻断效果仅略低于Vc。

3.3.3 不同桑椹试样对NDEA合成阻断率的比较

各试样桑椹醇提物对NDEA合成的抑制率结果见表2。由表2可知，在控制原花青素质量相同(质量浓度为238 μg/mL)时，15种桑椹试样阻断二乙基亚硝胺合成能力亦各不相同，0.8 mg/mL PR-01黑果桑和山东青岛黑果桑对NDEA合成阻断作用最大，分别达到了87.25%和87.20%，其次为野生蒙桑，阻断率为75.48%，作用最弱的为百草味桑椹干，仅为0.97%。

3.4 各试样桑椹醇提物清除亚硝酸盐、阻断NDEA合成的能力与其总酚和总黄酮含量的相关性

相关性分析结果显示(图5)，当醇提物中原花青素含量相同时，本实验供试的15种桑椹试样醇提物对亚硝酸盐的清除率、NDEA合成的阻断率与其总黄酮含量呈正向相关，其相关系数R2分别为0.829 6和0.960 8；各桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除率和NDEA合成阻断率与体系中总酚含量之间呈一定的正相关，但其相关系数较小，分别为0.529 1和0.639。以上结果表明，原花青素、多酚类物质、黄酮类物质可能是桑椹醇提物发挥作用的物质基础。

图5 桑椹醇提物对亚硝酸盐清除率、NDEA合成阻断率与总黄酮、总酚含量的相关性分析Fig.5 Correlation between nitrite scavenging rate,synthesis blocking rate of NDEA and total flavonoids content,total phenolics content of alcohol extract from fifteen mulberries samples.

4 讨论

目前从桑属植物中分离得到的化合物有近400个，以多糖、多酚类、黄酮类等活性物质为主[18,19]。利用有机溶剂(60%～95%的乙醇)在低温下浸提的桑椹提取物主要为黄酮类、多酚类和原花色素类等物质[11,20,21]。本文以75%乙醇提取15种桑椹活性物质，对其原花青素、总酚和总黄酮含量的检测结果显示，桑椹醇提物中原花青素含量占比相对较高，总酚次之，总黄酮最少；15种桑椹醇提物的原花青素、总酚和总黄酮含量存在显著差异，以PR-01黑果桑的总黄酮和原花青素含量均最高，野生蒙桑的多酚含量最高，并且以黑紫色桑椹鲜果总多酚含量较为丰富，该结果与闫祝炜等[15]研究结果一致。另外，3个不同产地的黑果桑鲜果原花青素和总黄酮含量差异较大，福建种植的PR-01黑果桑总黄酮含量(3.05 mg/g)也明显高于周庆颂等测定[22]的四川南充的桑椹总黄酮含量(最高2.074 mg/g)。可见，桑椹中有效成分的含量受品种、地质、环境、气候的影响。

本试验首次系统评价了富含活性成分的桑椹对亚硝酸盐的清除和NDEA生成的影响，结果显示，在模拟胃液条件下，随着浓度提高和反应时间延长，桑椹醇提物对亚硝酸盐的清除和阻断NDEA合成能力有较明显的提高，表明桑椹醇提物能在胃中有效清除亚硝酸盐和阻断NDEA合成，且在一定浓度范围内呈剂量依赖关系。本试验中除4种桑椹干及白珍珠果桑外，其它桑椹试样醇提物都表现出较好的清除 NaNO2及阻断NDEA合成的作用，其中PR-01黑果桑醇提物抑制亚硝化作用最强。在浓度为0.8 mg/mL、反应时间60 min 时，PR-01黑果桑醇提物对NaNO2的清除率最高达92.25%，而对NDEA合成的阻断率也最高，达87.25%，效果与Vc 相当，有望作为后续防癌功能食品的开发资源。

还原性成分的种类、含量及其氧化还原特性是果蔬消除亚硝酸盐能力的关键因素[23]。本研究结果发现， 11个桑椹试样醇提物对NDEA合成的阻断率均低于对亚硝酸盐的清除率，其余4个则相反，与前人[23]报道的一致，这可能是由于不同抗氧化剂和二乙胺竞争性与亚硝酸盐反应能力不同造成的。本试验以原花青素为基准设置不同桑椹醇提物浓度，发现其清除亚硝酸盐和阻断NDEA合成的效果随浓度的增加而提高，表明桑椹醇提物抑制亚硝化作用活性与其原花青素含量正相关。本试验相关性分析结果也显示，各样品桑椹醇提物对亚硝酸盐清除率、对NDEA合成阻断率与总黄酮、总酚含量呈一定的正相关，表明原花青素、多酚类物质、黄酮类物质可能是桑椹醇提物发挥作用的物质基础。另外，多酚类、黄酮类成分不同、含有的酚羟基数量及位置不同都可能影响到其对亚硝化反应的抑制作用。如AH-07黑果桑和野生蒙桑的醇提物原花青素含量相当，总酚和总黄酮含量不同，其清除亚硝酸盐活性亦有较大差别。因此，后续研究可进一步对桑椹醇提物进行色谱分离纯化，进一步探讨原花青素、多酚类物质和黄酮类物质的各单体结构与其抑制亚硝化作用之间的关系。这也可能是各桑椹试样醇提物对亚硝酸盐的清除率与其总酚、总黄酮含量的相关系数存在不同的原因

综上所述，桑椹醇提物富含原花青素、总酚和总黄酮等活性物质，在体外具有较好的清除亚硝酸盐和阻断NDEA合成的作用，15个桑椹试样中PR-01黑果桑表现出最高的原花青素含量(155.41±3.34 mg/g)和总黄酮含量(3.05±0.11 mg/g)，其醇提物也具有最强的对亚硝酸盐的清除率(92.40%)和对NDEA合成的阻断率(87.25%)，若开发PR-01黑果桑桑椹醇提物为食品添加剂或防癌功能食品，将对预防相关癌症具有重要的意义。