小檗碱对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖抑制作用及其分子机制研究

钱 洁，谭佳妮，程海波，沈卫星，徐长亮，刘陶世，孙东东*

1南京中医药大学转化医学研究中心 国家中医药管理局名医验方评价与转化重点研究室 江苏省抗肿瘤验方研究与 产业化工程实验室；2南京中医药大学药学院；3江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，南京 210023

小檗碱(Berberine)是一种临床上广泛使用的天然药物，属于季铵型异喹啉类生物碱，其存在于很多中药中[1-3]，常用于治疗由细菌感染引起的胃肠道疾病。近年报道发现，小檗碱在体外具有抗肿瘤活性，其机制主要集中在抑制肿瘤细胞增殖和扩散、干预细胞生长周期、影响细胞能量代谢以及诱导肿瘤细胞凋亡等[4]。乳腺癌作为主要在女性中发病的恶性肿瘤，小檗碱针对其显示较好的药效活性，但是小檗碱与乳腺癌治疗相关的具体作用机制尚不明晰，亟需补充完善[5]。本研究采用分子生物学技术研究小檗碱对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用，考察小檗碱对肿瘤细胞凋亡的影响，同时检测肿瘤相关通路蛋白表达，为进一步阐明小檗碱抗肿瘤机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

小檗碱购自美国sigma公司(货号B3240)，纯度为99%。3-MA购自MedChemExpress公司(货号HY-19312)。精密称取10 mg小檗碱粉末溶于二甲基亚砜(DMSO)中，超声助溶，配制成母液，-20 ℃低温储存，临用前再以培养基配成实验所需浓度试液，用0.22 μm的过滤器除菌，根据需求进行浓度梯度稀释。

1.2 细胞

MDA-MB-231乳腺癌细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，培养于含10% FBS，100 U/mL青链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱内，倒置显微镜观察生长情况。细胞融合度约90%时用胰蛋白酶消化传代或种板，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清(Capricorn scientific 公司，批号：1705124)；DMEM高糖培养基，胰蛋白酶溶液，青霉素-链霉素溶液(上海源培生物技术有限公司，批号：F40403，K40410，E40401)；MTT，DMSO(Sigma公司，批号：SP1080、SHBH2446V)；细胞裂解液(Bio-sharp公司，批号：6503595)；Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞凋亡检测试剂盒(BD公司，批号：556547)；MDC法细胞自噬染色检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20180109)；LC3A/B、Beclin 1、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR、Bax、BCL-2及β-actin抗体(CST公司，批号：12741T、3495T、2920S、2938T、13038T、5536T、4970T)CPA225D万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；Pall 超纯水系统(美国Pall公司)；SL16型低速离心机、FC型酶标仪、HER Acell 150i 型二氧化碳培箱(美国Thermo公司)；荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；Tanon-5500型化学发光凝胶成像仪器(中国天能科技有限公司)；PowerPacTM Basic型电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 检测细胞增殖抑制率

采用MTT法，取对数生长期的细胞，PBS漂洗，胰蛋白酶消化后终止消化并离心，培养基重悬，细胞计数后以1×105个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，设5复孔。24 h细胞贴壁后，分别加入不同浓度的小檗碱(0、10、20、40、80、100 μM)，孵育24、48、72 h后，各孔加入 MTT(5 mg/mL)20 μL，孵育箱孵育4 h后弃去上清，每孔加DMSO 150 μL，避光震荡10 min充分溶解沉淀后，酶标仪560 nm处检测吸光度。

公式如下：细胞增殖抑制率(%)=[(OD对照组-OD给药组)/OD对照组] ×100%。

1.5 观察细胞形态

取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，制成单细胞悬液，接种于6孔板中，调整浓度为1.0×106 cell /孔，培养箱中37 ℃，5% CO2环境下培养24 h，吸取上清，每孔加入2 mL含不同浓度小檗碱的培养基(3%血清，1%双抗)，对照组加含 3%胎牛血清的培养基，孵育24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.6 检测肿瘤细胞凋亡率

分别用25、50、100 μM浓度的小檗碱处理MDA-MB-231细胞24 h，同时设定空白对照组(DMSO，终浓度<0.05% (v/v))，每组设三个复孔，胰酶消化后，收集细胞。用缓冲液调整细胞浓度为1.0×106 个/mL，吸取100 μL的细胞至试管中，加入Annexin V试剂和PI各5 μL，避光孵育15 min后，于流式细胞仪检测。

1.7 干预细胞自噬实验

取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，调整浓度为1.0×106 cell /孔，37 ℃培养箱中培养24 h后弃上清，分别给予25、50、100 μM浓度的小檗碱刺激24 h。吸弃含药上清，用Wash Buffer洗两次，加入MDC染色工作液温室避光孵育15～45 min后，荧光显微镜观察并拍照。

1.8 细胞自噬相关蛋白表达

分别用25、50、100 μM小檗碱处理MDA-MB-231细胞24 h，同时设定空白对照组。用Western及IP裂解液裂解细胞，BCA试剂盒测定样品蛋白含量，并变性。应用8%～12% SDS-PAGE电泳后，采用湿转转膜方法，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入相应的一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日，用PBST洗膜3次，再加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h。ECL发光显影、凝胶成像系统拍照成像。利用应用Gel Analysis软件分析蛋白条带光密度，并通过与相应内参β-actin条带的密度做比较，测定样品中目的蛋白的相对含量。

1.9 调节细胞自噬相关通路蛋白表达

AKT-mTOR通路与细胞自噬密切相关，采用Western blot方法检测小檗碱作用于MDA-MB-231细胞24 h后对AKT及mTOR蛋白磷酸化的影响。

1.10 自噬与AKT-mTOR通路相关机制的验证

在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，加入3 mM PI3K-AKT信号通路抑制剂3-Methyladenine (3-MA)后，再加入50 μM小檗碱，孵育24 h 后，MTT法检测细胞活力。提取细胞蛋白，观察加入3-MA后，小檗碱对细胞自噬及凋亡相关蛋白的影响。

1.11 统计学分析

所得实验数据均采用 SPSS 12.0软件进行单因素方差分析，实验数据均以平均数±标准差((x±s) 表示，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗碱对MDA-MB-231细胞增殖抑制率的影响

MTT结果表明，MDA-MB-231细胞的增殖受到不同程度的抑制，并与小檗碱的给药剂量及时间成正相关。小檗碱对乳腺癌细胞在24、48、72 h的IC50值分别为:52.15 ± 3.87、49.28 ± 4.19和44.63 ± 3.26(见表1)。

表1 小檗碱对MDA-MB-231细胞增殖抑制率的影响

2.2 小檗碱对MDA-MB-231细胞形态的影响

观察结果显示，正常的MDA-MB-231细胞呈梭形，伸展，贴壁。而小檗碱给药组细胞呈现出不规则的形态，细胞膜明显皱缩，细胞质高度浓缩，细胞外出现类似碎片，细胞间距变大。随着小檗碱给药浓度的增加，细胞的贴壁能力明细下降(见图1)。

图1 小檗碱对MDA-MB-231细胞形态的影响(20×)Fig.1 Effect of berberine on the morphology of MDA-MB-231 cells (20×)

2.3 小檗碱对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

流式细胞实验结果表明，小檗碱给药24 h后细胞的总凋亡率分别为21.4% ± 3.43% (25 μM)、31.2% ± 5.22% (50 μM)和80.6% ± 6.45% (100 μM)，与空白对照组(0.1% ± 0.1%)相比较，有显著性差异(P< 0.05)，提示小檗碱具有明显的诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡的作用(见图2)。

图2 小檗碱对MDA-MB-231细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of berberine on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 小檗碱对MDA-MB-231细胞自噬的影响

MDC是自噬泡特异性的荧光标记物，结果显示，小檗碱各给药组细胞内MDC绿色荧光增强，且随着处理浓度增加，荧光强度也逐渐增加。提示小檗碱可以诱导MDA-MB-231细胞自噬泡的形成(见图3)。

图3 小檗碱对MDA-MB-231细胞自噬的影响(20×)Fig.3 Effect of berberine on autophagy of MDA-MB-231 cells (20×)

2.5 小檗碱对MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白表达的影响

LC3蛋白存在LC3A及LC3B两种形式，结果表明，当乳腺癌MDA-MB-231细胞给予小檗碱后，细胞内LC3A蛋白表达减少，而LC3B蛋白表达增多。随着小檗碱给药浓度的增加，LC3B/LC3A表达量比也增加。同时自噬正调节因子Beclin 1表达也呈现增加的趋势(见图4)。

图4 小檗碱对MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of berberine on the expression of autophagy-related proteins in MDA-MB-231 cells

2.6 小檗碱对调节MDA-MB-231细胞自噬相关通路蛋白表达的影响

Western blot结果表明，小檗碱抑制细胞内

AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值降低(见图5)。

图5 小檗碱对调节细胞自噬相关通路蛋白表达的影响Fig.5 Effect of berberine on the regulation of protein expression in autophagy-associated pathway

2.7 3-MA对细胞增殖、自噬及凋亡相关蛋白表达的影响

MTT结果表明，3-MA可抑制小檗碱给药后出现的细胞活力降低的现象(图 6A)；Western-blot结果显示，3-MA显著抑制了LC3B/LC3A比值增大的趋势(图 6B、C)，提示3-MA可抑制由小檗碱引起的细胞自噬的产生。此外，3-MA具有抑制小檗碱引起的凋亡相关蛋白Bax的表达增高、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低的现象(图 6D)。说明AKT介导的细胞自噬是小檗碱诱导细胞凋亡的原因之一。

图6 3-MA对小檗碱引起的细胞自噬及凋亡的影响Fig.6 Effect of 3-MA on autophagy and apoptosis induced by berberine

3 讨论

自噬是把双刃剑，其与细胞凋亡在不同的条件下相互协调、相互影响，对肿瘤的发生发展起着重要的调节作用[6]。在癌症形成的早期阶段，自噬具有抑制肿瘤增殖的作用。但同时，自噬也可使癌细胞适应不利的代谢应激(如缺氧、低营养状态等)从而使肿瘤细胞存活[6-8]。因此，在癌症早期，抗肿瘤药通过激活细胞自噬可有效抑制肿瘤的生长，同时介导肿瘤细胞发生自噬性死亡。本实验通过MDC染色，荧光显微镜观察发现小檗碱可以诱导MDA-MB-231细胞自噬泡的形成。同时，Annexin V-PI染色结果显示，小檗碱具有明显的诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡作用,提示小檗碱可能通过诱导肿瘤细胞自噬与细胞凋亡发挥抑制细胞增殖的作用。

LC3和Beclin 1是自噬体经典的标志蛋白。LC3包括LC3A及LC3B两种形式，当自噬发生时，细胞质中的LC3A会转变成自噬体膜上的LC3B蛋白，从引起LC3B蛋白表达增加[9]。而Beclin 1是一个重要的抑癌蛋白，Beclin 1的单等位基因缺失会造成自发性癌症发病率的提升[10]，本实验通过Western Blot检测发现，给药后的乳腺癌细胞中LC3B/LC3A蛋白表达的比值及自噬正调节因子Beclin 1的表达与小檗碱浓度成正相关，表明小檗碱可以诱导乳腺癌细胞自噬的发生。AKT-mTOR (mammalian target of rapamycin)通路是调节细胞增殖及凋亡的重要通路[11]，研究发现，乳腺癌患者存在mTOR蛋白过度激活的现象[12,13]。此外，mTOR是细胞自噬在启动过程中的关键靶点通路[14,15]，活化后可发挥抑制细胞自噬的作用。在本实验中，Western Blot结果显示，MDA-MB-231细胞在给予不同浓度的小檗碱后，细胞内AKT及mTOR蛋白的磷酸化水平受到不同程度的抑制，说明小檗碱通过抑制细胞中AKT-mTOR通路，从而发挥诱导乳腺癌细胞发生自噬的作用。

课题组长期以来对国医大师周仲瑛临床防治肿瘤的系列验方消癌解毒方开展研究，其中应用于乳腺癌的方中主要有天葵子、八月札、白毛夏枯草、漏芦、柴胡以及天冬等药味，天葵子作为君药，生物碱是其含有的一类主要成分[2]，且课题组在前期的实验也已从中分离得到小檗碱[3]。本研究表明，通过抑制AKT-mTOR通路，诱导细胞的自噬以及凋亡过程，是小檗碱发挥体外抑制乳腺癌细胞增殖效应的一个重要路径，所以说实验结果为进一步阐释小檗碱的抗肿瘤分子机制提供了重要依据，同时为揭示抗肿瘤中药天葵子的药效物质基础，以及复方抗肿瘤的临床应用与转化提供有效参考。