Bcl-2改善老年人骨髓间充质干细胞抗缺氧损伤能力的研究

陈 巍 张东旸 白 龙 范 明 蒋树林 田 海

既往研究已经证实，骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）能有效改善心肌梗死后的心脏功能[1-2]。然而，近年来在临床研究中应用自体hMSCs移植治疗心肌梗死的效果却不理想。前期研究中，我们发现临床心肌梗死患者多为老年人并进一步证实了自体干细胞移植治疗心肌梗死效果不佳的主要原因与供体年龄相关，老年人hMSCs移植后的大量死亡可能影响了治疗效果[3]。为进一步探索改善老年人hMSCs治疗心肌梗死效果的方法，本次研究将B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）转染至老年hMSCs，以期增强老年hMSCs移植后的在心肌梗死心脏的存活能力，观察能否增强老年hMSCs移植治疗心肌梗死的效果。

材料与方法

1.材料 研究开始前我院伦理委员会讨论并通过了本实验中人类骨髓的获取及研究，骨髓来源于我院心脏外科手术患者，取材前详细告知患者或其家属骨髓取材过程及用途，并签订知情同意书，老年人骨髓来自于50～70岁心脏瓣膜病患者，有发绀、肝炎、梅毒、严重器官功能障碍或肺动脉高压的患者均被排除在供体选择之外。大鼠由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供，选择12周龄清洁级雌性Wistar大鼠，体质量200～250g。转染用重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-2购于上海生博医学生物工程科技有限公司，Inspira小动物呼吸机厂商为Harvard Apparatus。

2.方法 （1）老年人hMSCs的分离、培养及鉴定 心外科手术正中开胸前，于胸骨抽取5 mL骨髓并加入等量的PBS后充分混匀，于离心管中加入与骨髓和PBS混合液等量的Ficoll离心液，并按1∶1的比例小心加入骨髓与PBS的混合液，以400倍重力，4℃条件下离心20min后，取中间白色单核细胞层接种到培养瓶中，用含10%胎牛血清和抗生素的IMDM培养基在含5%CO2的37℃培养箱中培养48 h后更换培养液，此后每隔2～3 d换一次培养液至细胞80%汇合时，应用胰酶消化法（0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA）消化和传代。第3代细胞使用流式细胞仪进行鉴定，CD29、CD90、CD105阳性而CD34、CD45、CD133阴性的即为目的细胞。

（2）Bcl-2转染老年hMSCs及鉴定 应用上海吉玛制药技术有限公司提供Bcl-2质粒进行扩增和提取后，按照转染试剂盒说明书步骤将Bcl-2基因转染至老年hMSCs，利用绿色荧光蛋白在转染后48 h在荧光倒置显微镜下观察细胞转染情况并应用流式细胞仪检测细胞转染效率。

3.体外缺氧培养模型的建立 用含10%胎牛血清的培养液将转染前后的老年hMSCs配成单个细胞悬液，每组细胞每次测量共设3个复孔，以5 000个/孔的密度铺于事先置于24孔板中的细胞载玻片上，每孔100μL的10%胎小牛血清IMDM在含5%CO2、37℃培养箱中培养24 h，各孔更换无血清IMDM培养液至终体积500μL，置于用含5%CO2和95%N2的混合气体调整氧浓度至2%的37℃缺氧培养箱中培养24 h。

（4）缺氧培养后各组细胞凋亡的检测 将转染前后的老年hMSCs经过缺氧培养后，按照试剂盒说明书步骤应用Annexin V/PI双染色法测定各组细胞缺氧前后早期凋亡情况并进行对比。

（5）大鼠心肌梗死模型的制备 Wistar大鼠，6～8周龄，（250±20）g，按体质量给予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，16G静脉留置针气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，以心尖搏动最强点为中心，沿第四肋间做横行切口，约2～3 cm，依次切开皮肤、筋膜及肋间肌肉，以自制肋间拉钩暴露术野，撕开心包，结扎点在肺动脉圆锥和心尖连线上，于左心耳下方1～2mm处进针，方向与左心耳的边缘平行，进针深度约1.5mm，结扎时可见冠脉远端心肌变白，室壁运动明显减弱，冠状动脉结扎后15 min，将转染前后老年hMSCs 2×106个细胞与同等体积培养基混合后注射到在缺血区和正常心肌交界区域，共选择3点，每点约40μL，关胸后每日观察大鼠情况。

（6）各组细胞移植后的存活检测 术后四周大鼠腹腔注射9 mL/kg的10%水合氯醛，麻醉过量致死，迅速开胸，阻断主动脉远端，于近端灌注4℃心脏停跳液约5 mL，至心脏停跳，取下心脏置于4%多聚甲醛中固定48 h，95%乙醇脱水，常规石蜡包埋。切片应由心尖至心底按短轴平面连续切片，保证心尖、心底和心肌梗死区域都能切到，每张切片厚度约5μm。组织切片经人线粒体染色后存活细胞呈棕色，每只实验动物随机选取3张切片，每张切片选取5个放大200倍视野进行观察，计数每个视野内阳性染色的细胞数，从而计算各组细胞移植后的存活数量。

（7）各组细胞移植后心功能的检测 设定单纯心肌梗死大鼠模型为对照组，以及老年细胞移植组和Bcl-2转染后老年细胞移植组。实验大鼠在梗死模型建立前、梗死模型建立后1周、2周和4周行心脏超声测量心功能。大鼠以3 mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，胸部剪毛，置仰卧位。11.5MHz探头检测对照组及各组细胞移植后不同时间点的EF并进行对比分析。

3.统计学方法 使用SPSS19软件进行统计分析。所有计量数据都采用均值±标准差表示，比较分析采用t检验，采用重复测量方差比较分析超声心动图检测各组细胞移植后心功能情况。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.老年hMSCs的培养、鉴定及转染 按前述方法在术中获得的骨髓经分离培养至第3代时，所获细胞形态呈间充质干细胞的长梭型、成旋涡状或放射状排列，经流式细胞仪测定稳定表达表面抗原CD29、CD90、CD105，不表达其他干细胞细胞表面抗原CD34、CD45、CD133，转染Bcl-2基因后能够稳定表达所带绿色荧光蛋白，经流式细胞仪检测细胞转染效率为11.5%（图1）。

2.缺氧培养后的细胞凋亡情况 按前述方法进行Anexin V/PI双染后通过流式细胞仪检测，可见缺氧前转染前后O-MSC（the old mesenchymal stem cells）的早期凋亡几乎没有，而缺氧后两组细胞的早期凋亡细胞数均有增多，且O-MSC组的早期凋亡细胞数较多（图2～4）。

3.移植后的细胞存活情况 两组O-MSC移植术后四周，大鼠心脏切片经人线粒体特异染色结果可见O-MSC+Bcl-两组沿注射路径分布的移植细胞呈圆形、被染成棕黄色，而O-MSC组中几乎见不到存活的移植细胞（图5～6）。

4.移植后的心功能 超声心动图结果所示术前各组间射血分数无差别，术后不论是一周、两周还是四周，O-MSC+Bcl-两组的射血分数与两外两组相比均有差异，对照组和O-MSC组相比未见到差异，因此移植O-MSC+Bcl-两组的射血分数与对照组和移植O-MSC组相比得到了明显提高（图7）。

图1 Bcl-2的转染情况A：O-hMSCs转染Bcl-2的GFP表达（400×）； B：流式细胞仪测定Bcl-2的转染效率

图2 缺氧处理前的O-MSC A：处理前OMSC；B：转染Bcl-2的O-MSC

图3 缺氧处理后的O-MSC A：处理后O-MSC；B：转染Bcl-2的O-MSC

图4 缺氧处理前后两组细胞的早期凋亡对比分析

图5 术后四周大鼠心脏梗死边缘区镜下所见细胞存活情况（x400）A：O-MSC+Bcl-2；B：O-MSC，箭头所指为人线粒体染色阳性细胞

图6 两组细胞移植术后四周大鼠心脏梗死边缘区细胞存活情况

图7 对照组、O-MSC组和O-MSC+Bcl-两组术前、术后一周、两周及四周射血分数

讨 论

虽然既往大量动物实验已经证实骨髓间充质干细胞移植能够有效改善心肌梗死后的心脏功能[4]，但在临床研究中应用自体间充质干细胞治疗心肌梗死效果明显低于动物实验的结果[5]。通过研究分析我们已经证实，由于老年hMSCs在缺氧环境下的存活能力、血管再生能力和改善间质重构能力明显弱于年轻患者[3]。因此，如果能够增强老年hMSCs在心肌梗死区域的存活数量及存活时间即可解决自体干细胞移植治疗心肌梗死的效果。

细胞凋亡的分子和生化机制迄今虽尚未彻底明了[6-7]，但已形成的初步认识大多源于对Bcl-2基因家族的研究[8-9]，而Bcl-2基因的抑制凋亡作用在近年来的一些研究已得到了较为深入的研究，其抗凋亡作用已被广泛认可[10]。Bcl-2抗细胞凋亡的机制可能在于Bcl-2与凋亡促进基因Bax形成二聚体、通过直接或间接的方式阻止胞浆内细胞色素C对Caspases蛋白酶的激活、通过直接或间接地影响内质网中Ca2+的释放等[11]，从而实现抑制或调节细胞凋亡的发生。在我们的前期研究中发现年轻hMSCs中的Bcl-2含量明显高于老年hMSCs，而年轻hMSCs的抗缺氧损伤能力明显强于老年hMSCs。因此，我们认为年龄可能影响了骨髓间充质干细胞Bcl-2的分泌，使得这种能够抑制细胞凋亡发生的“抗凋亡基因”随着年龄的增高而减少，从而减少了老年hMSCs移植后的存活数量进而减弱了其治疗心肌梗死的效果。在本项研究中，我们尝试利用Bcl-2基因修饰了O-hMSC，使得转染后的O-hMSCs在缺氧的培养环境中和移植至缺血缺氧的心肌梗死区域时均具有更强的存活能力，进而在动物实验中证实了此种方法能够增强O-hMSCs移植治疗心肌梗死的效果。

因此，利用转基因技术增强自体骨髓间充质干细胞存活能力的方法为解决目前自体骨髓间充干细胞治疗缺血性心脏病效果不佳的难题提供了可能的解决方案，进而解决目前药物治疗、介入治疗及手术治疗难以改善缺血性心脏病患者远期心功能对临床医生造成的困扰，从而改善广大缺血性心脏病患者的远期生存质量和存活率。