MiR⁃17⁃5p/BTG3 调节胶质瘤的作用机制

金世光 戴燕 李城 李昌熙 王大新

扬州大学临床医学院1医学实验研究中心，2疼痛科（江苏扬州225001）

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的40%～50%［1］，胶质瘤临床治疗的点难主要是由于其临床表现和症状、影像学或形态学预警及其浸润性没有显著的特征［2-3］。本课题组前期研究［4］发现，miR⁃17⁃5p 在胶质瘤中促进细胞增殖和侵袭。同时，利用生物信息学技术预测了miR⁃17⁃5p 靶基因BTG3（B⁃cell translocation gene 3），而BTG3 参与PI3K⁃AKT 信号通路。本研究目的旨在寻找miR⁃17⁃5p 作用的直接靶基因BTG3，而BTG3 参与PI3K⁃AKT 信号通路，从而阐明miR⁃17⁃5p 调节胶质瘤细胞增殖迁移的分子机制，并为寻找结胶质瘤的治疗性靶标提供理论基础与实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 0.25%胰蛋白酶消化液，RNA 酶，10%胎牛血清H⁃DMEM 培养液，胶质瘤细胞系U87⁃2M1、SW1088，pmirGLO 载体，TBST 溶液。

1.2 仪器 qRT⁃PCR 仪（ABI StepOne Plus），生物安全柜1205A（FORMA），CO2培养箱（FORMA），倒置显微镜IX70（OLYMPUS），酶标仪（TECAN）。

1.3 实验方法

1.3.1 利用生物信息学技术预测靶基因BTG3 TargetScan 程序，miRanda 程序和DIANA⁃microT 程序预测miR⁃17⁃5p 作用的直接靶基因，将三者中有两个或两个以上程序同时预测到的基因作为候选的靶基因，结合miR⁃17⁃5p 促进胶质瘤增殖迁移以及促进对化疗抗性的生物学表型的特点，筛选出候选的靶基因BTG3。

1.3.2 细胞转染 转染前一天接种细胞于24孔板，0.5 mL 无抗生素培养基每孔，第2 天转染时细胞达到60%～80%每孔。脂质体（lipofectamine 3000）转染质粒与细胞中，混匀。孵箱37 ℃培养48 h。

1.3.3 双荧光素酶报告基因检测 裂解细胞后，12 000 r/min 离心5 min，取上清。按照每个样品需100 μL 的量，取适量Renilla 荧光素酶检测缓冲液，按照1∶100 加入Renilla 荧光素酶检测底物（×100）配制成Renilla 荧光素酶检测工作液。每个样品测定时，取样品50 μL，加入100 μL 萤火虫荧光素酶检测试剂，以报告基因细胞裂解液为空白对照。Renilla 荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU 值除以Renilla 荧光素酶测定得到的RLU 值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。

1.3.4 qRT⁃PCR 验证miR⁃17⁃5p 与BTG3 关系U87⁃2M1 细胞中分别转染mimics control、miR⁃17⁃5p mimics、SW1088 细胞分别转染ASO⁃NC、miR⁃17⁃5p ASO 后，37 ℃细胞培养箱中孵育48 h 后，利用qRT⁃PCR 检测。

1.3.5 Western Blot 验 证miR⁃17⁃5p 与BTG3 关系 细胞裂解后分别取20 μL 蛋白样品上样，进行SDS 变性10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶取出，转膜1 h，封闭30 min，含一抗的TBST 溶液中过夜。漂洗5 min，共3 次，加入含二抗的TBST（Tris⁃Buffered Saline and Tween 20）溶液中室温放置1 h。摇动漂洗5 min，共3 次，将膜置于超敏发光液中2 min，进行显影、定影处理。

1.3.6 利用过表达和RNAi 的方法，检测靶基因表达水平的变化对胶质瘤细胞增殖迁移的影响 将靶基因的过表达载体pcDNA3/target 转染进入SW1088 和U87⁃2M1 细胞中，进行瞬时表达。以pcDNA3 作为阴性对照。而将针对靶基因的siRNA表达载体pSilencer/sh⁃target 转染进入SW1088 和U87⁃2M1 细胞中，pSilencer/control 作为阴性对照。通过MTT 法和Transwell 侵袭实验检测细胞的增殖迁移能力。

1.4 统计学方法 应用SPSS 12.0统计分析软件，统计学处理采用单因素方差分析进行检验。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 利用生物信息学技术预测靶基因BTG3 利用生物信息学技术预测miR⁃17⁃5p 的靶基因，结果miR⁃17⁃5p 与靶基因互补结合的具体位点见图1。

图1 生物信息学预测miR⁃17⁃5p 与靶基因BTG3 的结合位点Fig.1 Bioinformatics to test miR⁃17⁃5 p and target genes BTG3 binding sites

2.2 荧光素酶报告实验验证miR⁃17⁃5p 对候选靶基因BTG3 的直接调控作用 实验结果表明，转染pmirGLO，过表达miR⁃17⁃5p 以及封闭miR⁃17⁃5p，荧光值均没有变化。转染pmirGLO/BTG3⁃UTR，过表达miR⁃17⁃5p 后，荧光值降低；miR⁃17⁃5p被封闭后，荧光值上升（P＜0.05）。转染pmirGLO/BTG3⁃mUTR，过表达miR⁃17⁃5p 以及封闭miR⁃17⁃5p，荧光值均没有变化，见图2。

图2 荧光素酶报告实验检测miR⁃17⁃5p、BTG3 表达水平Fig.2 Luciferase detected expression of miR⁃17⁃5 p and BTG3

2.3 qRT⁃PCR 检测miR⁃17⁃5p、BTG3 表达水平 实验结果表明，U87⁃2M1 中细胞中过表达miR⁃17⁃5p 后，miR⁃17⁃5p 表达量升高、BTG3 表达量降低（P＜0.05）。SW1088 细胞中miR⁃17⁃5p 被封闭后miR⁃17⁃5p 表达量降低、BTG3 表达量升高（P＜0.05），见图3。

图3 qRT⁃PCR 检测miR⁃17⁃5p、BTG3 表达水平Fig.3 The mRNA levels were detected byqRT⁃PCR

2.4 Western Blot 验证miR⁃17⁃5p 与BTG3 关系 实验结果表明，过表达miR⁃17⁃5p 后，BTG3 蛋白含量降低。miR⁃17⁃5p 被封闭后，BTG3 蛋白含量升高（P＜0.05），见图4。

2.5 靶基因BTG3 与胶质瘤细胞增殖之间的联系 MTT 实验检测U87⁃2M1 细胞、SW1088 细胞各组细胞吸光值结果显示，与母细胞相比，BTG3 沉默的细胞增殖速率加快，而过表达BTG3 的细胞增殖速率减慢，即BTG3 的表达量与U87⁃2M1 细胞的增殖速率呈负相关（P＜0.05），见图5。

2.6 靶基因BTG3 与胶质瘤细胞侵袭之间的联系 Transwell 侵袭实验结果显示，U87⁃2M1 细胞、SW1088 细胞中过表达BTG3 后穿过上室的细胞数量减少，即细胞侵袭速率减慢，而沉默BTG3 后细胞侵袭速率加快（P＜0.05），见图6。

3 讨论

图4 Western Blot 检测BTG3 蛋白含量Fig.4 Western Blot testedBTG3 protein level

图5 MTT 实验检测细胞增值情况Fig.5 Cell proliferation detected by MTT

图6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力（×200）Fig.6 Transwell tested cell invasion（×200）

恶性胶质瘤呈浸润性生长，无法根治，预后差，术后复发率高，易出现侵袭转移、进展迅速、病死率高等特点［5-7］。恶性肿瘤患者中有15%～25%会发生脑转移［8-9］。miRNAs 参与细胞的增殖、凋亡、细胞分化等多种生物学行为，同时也可参与恶性肿瘤的侵袭、迁移、肿瘤微环境的调节［10-14］。miR⁃17⁃5p 在肝癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌等中的功能已经文献报道［15-19］。

本研究在前期实验中证实了miR⁃17⁃5p/BTG3在胶质瘤的增殖迁移中发挥着重要作用。为了深入了解miR⁃17⁃5p/BTG3 在胶质瘤细胞中的作用机制，通过生物信息学软件（TargetScan，miRanda 和DIANA⁃microT）预测发现miR⁃17⁃5p 与蛋白BTG3的3′UTR 有结合位点。然后，通过荧光素酶报告实验证实了miR⁃17⁃5p对BTG3具有靶定作用。而相关文献报道BTG3 抑制PI3K⁃AKT 信号通路的激活，推断miR⁃17⁃5p/BTG3 通过Akt 信号通路发挥作用，促进胶质瘤的恶性进展。为了验证miR⁃17⁃5p/BTG3 在胶质瘤细胞中的作用机制，首先，通过qRT⁃PCR、Western Blot 验证了miR⁃17⁃5p 对候选靶基因BTG3 的直接调控，且具有负调控作用。然后，通过MTT 法、Transwell 侵袭实验检测靶基因BTG3 对细胞增殖迁移的影响。实验结果显示靶基因BTG3 可介导miR⁃17⁃5p 对胶质瘤细胞增殖和侵袭具有调控作用。不足之处在于实验结果主要以体外实验进行，为了进一步证明miR⁃17⁃5p/BTG3 在胶质瘤细胞中的具体作用机制，下一步工作中在体内裸鼠实验研究miR⁃17⁃5p/BTG3 对胶质瘤增殖迁移的影响。因此，本研究理解胶质瘤细胞增殖迁移的分子机制提供有意义的研究线索，并为寻找胶质瘤的治疗性靶标提供理论基础与实验依据，这为今后恶性胶质瘤基因治疗提供新的方向。