淫羊藿次苷Ⅱ通过改善内质网应激和caspase-12信号改善SHR大鼠左心室功能

吴雨婷，李叶丽，付 舒，岳 云，孙瑞敏，杨丹莉

(遵义医学院，基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563003)

心力衰竭是导致全球发病率和死亡率升高的主要原因，其中高血压是最主要的危险因素，大约75%的心衰患者伴有血压升高[1]。心肌细胞凋亡是决定心脏结构和功能的关键因素，在心力衰竭患者和动物模型中都有心肌细胞凋亡[2]。心肌细胞凋亡除了使细胞数目减少，还可阻止氧化磷酸化过程，减少ATP生成，导致细胞能量障碍[3]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在心肌细胞凋亡中起重要作用[4]。受应激刺激时，GRP78与内质网跨膜信号转导子解离，使之激活，从而激活一系列凋亡信号，导致细胞凋亡[5]。Caspase-12酶原的激活是ERS诱导细胞凋亡的特异性分子之一[6]。

淫羊藿可用于治疗心血管疾病、神经退行性疾病和性功能障碍。淫羊藿次苷Ⅱ (icariside Ⅱ, ICS Ⅱ)是淫羊藿的活性成分之一，也是淫羊藿苷的活性代谢产物。淫羊藿苷能够通过抑制ERS，减轻衣霉素诱导的H9c2细胞凋亡[7]。我们之前的研究已经表明，ICS Ⅱ能够降低自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)血压、减少心肌细胞凋亡[8]。因此，本研究旨在证实ICS Ⅱ改善左心室功能的作用，并初步探讨其机制是否与ERS及caspase-12信号有关。

1 材料

1.1实验动物30只14周龄的♂SHRs，6只魏凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号: SCXK(京)2012-0001。

1.2药物与试剂ICS Ⅱ，购自南京泽朗医药有限公司(批号：FY17460602，经高效液相色谱法检测其纯度≥ 98%，有效期24个月)，将ICS Ⅱ溶于适量双蒸水中，并加入纤维素钠制成混悬液，每次灌胃前先超声混匀。RNA逆转录试剂盒、荧光混合物、GRP78和GAPDH引物(TaKaRa生物工程公司)；GRP78、cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3抗体(美国Abcam公司)；GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.3仪器Vevo2100小动物超声检测仪(加拿大VisualSonics公司)；RNA逆转录仪(德国Eppendorf公司)；i-mark酶标仪、real-time PCR扩增仪、迷你 PROTEAN3电泳仪、迷你Trans-Blot转移系统、CCD成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1实验动物分组WKY作为空白对照组，SHRs随机分为模型组、ICS Ⅱ低、中、高剂量组和阳性药组，每组6只。ICS Ⅱ组分别灌胃给予ICS Ⅱ 4 、8、16 mg·kg-1至26周龄，阳性药组给予氯沙坦20 mg·kg-1，空白组和模型组给予等体积双蒸水。

2.2大鼠左心功能检测在第26周最后一次给药结束后，大鼠麻醉后剃除左侧胸部鼠毛，将其固定在检测台，并涂抹藕联合剂。然后使用Vevo2100小动物超声设备获取M型超声心动图。测量左心室舒张末期内径、左心室后壁舒张末期厚度、射血分数和短轴缩短率。记录连续10个心动周期的平均值。

2.3Real-timePCR法检测左心室组织中GRP78mRNA水平提取大鼠左心室组织RNA，经两步法-聚合酶链反应后，检测GRP78、GAPDH mRNA的水平。反应条件为：第1阶段：95 ℃预变性10 min；第2阶段：PCR反应(95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，进行40次循环)；第3阶段：熔解曲线分析(从55 ℃开始，每5 s下降0.5 ℃，进行80次循环)。引物序列见Tab 1。用相对定量法计算目的基因水平，以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数(cycle threshold，Ct值)为统计参数，计算下列数据，Ct值的平均值=(Ct l+Ct 2)/2(重复管)；dCt=Ct值的平均值-中间值(相同检测基因的不同样品Ct值的平均值中居中的值)；基因的表达=2-dCt；相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达，将空白组mRNA表达设为1。

Tab 1 Primer pairs used in real time PCR

2.4Westernblot法检测左心室组织中GRP78、cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表达取大鼠左心室组织30 mg，剪碎后加入1 mL RIPA裂解液，冰上匀浆后，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制剂各10 μL，静置30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，取上清液获取蛋白样本，BCA法测定样本浓度。蛋白上样量为10 μL(含30 μg蛋白)，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。然后转至PVDF膜上，5%蛋白封闭液封闭2.5 h，一抗GAPDH(1 ∶10 000)、GRP78 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-12 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-9 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-3 (1 ∶2 000) 4 ℃孵育过夜，二抗(1 ∶2 000)常温孵育1.5 h，ECL化学发光显色，CCD成像系统获取图像。将WKY组蛋白表达设为1。

3 结果

3.1ICSⅡ对SHRs左心功能的影响Fig 1超声结果显示，与WKY组相比，SHR组左心室舒张末期内径和左心室后壁舒张末期厚度增加(P<0.05)，而射血分数和短轴缩短率降低(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ中、高剂量及阳性药组左心室舒张末期内径和左心室后壁舒张末期厚度降低(P<0.05)，射血分数和短轴缩短率增加(P<0.05)。

3.2ICSⅡ对SHRs左心室组织中GRP78mRNA和蛋白水平的影响与WKY组相比，SHR组GRP78 mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，经ICS Ⅱ和氯沙坦治疗后，GRP78 mRNA和蛋白水平不同程度降低(P<0.05)，见Fig 2。

Fig 1 Effect of ICS Ⅱ on left ventricular function in SHRs n=6)#P<0.05 vs WKY; *P<0.05 vs SHR

Fig 2 Effect of ICS Ⅱ on levels of GRP78 mRNA(A) and protein(B) in left ventricle tissues of SHRs n=6)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

3.3ICSⅡ对SHRs左心室组织中cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白水平的影响如Fig 3所示，与WKY组相比，SHR组cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白表达明显上调(P<0.05)；而给予ICS Ⅱ各剂量及氯沙坦治疗后，cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白水平下调(P<0.05)。

Fig 3 Effect of ICS Ⅱ on levels of cleaved-caspase 12/9/3 protein in left ventricle tissues of SHRs n=3)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

4 讨论

高血压是全球常见疾病，是心脑血管事件的主要危险因素[9]。改善左心功能和预防高血压心脏病是治疗高血压的重要策略[10]。在本研究中，我们检测了大鼠的左心室功能，模型组左心室舒张末期内径和后壁舒张末期厚度增加，而射血分数和短轴缩短率降低，表明26周龄SHRs左心功能减退，而ICS Ⅱ能够改善SHRs左心功能。在课题组之前的研究中，已经确定ICS Ⅱ能够降低SHRs血压，并减少心肌细胞凋亡[8]，血压降低是其心肌细胞凋亡减少的原因之一。在本研究中，课题组基于ERS-心肌细胞凋亡，进一步研究ICS Ⅱ改善左心功能的作用机制。

内质网是一种广泛存在于真核生物的膜性细胞器，主要负责调节蛋白质合成、折叠、运输和细胞内钙水平[11]。血压升高引起细胞内环境变化，阻断蛋白质加工，导致内质网中未折叠/错误折叠蛋白累积[12]。GRP78是促进蛋白质正确折叠的重要分子伴侣，其水平间接反映了ERS水平[13]。本研究中，SHR组左心室GRP78蛋白表达明显上调，表明SHRs左心室心肌细胞发生了ERS。同时，在中、高剂量ICS Ⅱ组，上调的左心室GRP78蛋白表达被抑制，表明ICS Ⅱ可抑制SHRs心肌细胞的ERS。文献报道，ERS可通过激活一系列凋亡信号，诱导细胞凋亡[5]。结合既往研究中，ICS Ⅱ能够减少SHRs心肌细胞凋亡[8]，因此，我们推断ICS Ⅱ改善SHRs左心室功能，与其抑制ERS、减少心肌细胞凋亡有关。

caspase-12途径是ERS-细胞凋亡的途径之一。caspase-12属于启动子半胱天冬酶，具有长的N末端前结构域，介导蛋白质复合物的形成，caspase-12酶原可在ERS诱导的细胞凋亡中被激活。caspase-12酶原与肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2) 结合形成复合物，当发生ERS时，TRAF2从该复合物中解离，诱导caspase-12的激活[14]。此外，caspase-12酶原还可单独位于内质网外膜，胞质中Ca2+升高导致钙蛋白酶活化，并转位至内质网膜，激活caspase-12。而活化的caspase-12可以启动一个正反馈回路，通过caspase-9的活化来激活caspase-3[15]。caspase-3是执行凋亡的半胱天冬酶，通过在天冬氨酸残基处切割产生p12和p17亚基而激活，激活的caspase-3切割各种DNA修复酶和结构蛋白，导致细胞凋亡[16]。本研究中，模型组cleaved-caspase-12/9/3蛋白水平增加，表明26周龄SHRs通过激活caspase-12信号，导致心肌细胞凋亡；而ICS Ⅱ能够下调caspase-12信号，减少心肌细胞凋亡，进而改善左心室功能。

综上，ICS Ⅱ能够改善SHRs左心室功能，其作用机制与改善ERS，下调caspase-12信号有关。

(致谢：本实验在遵义医学院基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室完成，感谢吴栋清、吴芹、黄波提供的帮助!)