紫苜蓿黄酮含量和抗菌活性研究

杨蕾 梁倩 李乔仙 蒋达青 王芳 伍建榕

摘要：采用乙醇超声提取，加水悬浮，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，测定了石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相4部分的黄酮含量，并以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌5种细菌为供试菌株，采用抑菌圈法测定了其抑菌活性。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相的黄酮含量分别为3.47%，14.49%，9.13%和0.43%，其中，乙酸乙酯相具有显著的抑菌效果，其它相抑菌效果不显著，乙酸乙酯对供试菌株枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）分别为1.5、1.5、3.0、2.0和2.5mg/mL。

关键词：紫苜蓿;黄酮含量;抑菌活性

紫苜蓿（Medicago saliva Linn.）为豆科（Legumi-nosae）蝶形花亚科（Faboideae）苜蓿属（Medicago L.）多年生草本，被誉为“牧草之王”[1]。紫花苜蓿主要分布于我国西北、华北、东北、西南地区，其种植面积大、产量高。研究发现紫苜蓿有较高的利用价值，具有降低胆固醇和防治冠心病作用[2，3]，在抗旱，改良土壤，防止水土流失，保护生态环境等方面也起到积极的作用[4]。紫苜蓿主要含有黄酮、皂苷、香豆素、甾醇、单萜和有机酸等化学成分[5]。

黄酮类化合物（flavonoids）作为一大类天然、绿色、低毒、可再生的植物化合物，广泛地存在于自然界的植物中[7]，具有抵御紫外线、抗菌免疫、抗氧化、抗艾滋病毒、抗肿瘤及微量雌激素作用等方面生理和药理活性[8]。由于抗生素的滥用，病原菌日益产生的耐药性给全球公共卫生带来了严峻的挑战[9]，研发新的抗菌药物成为医药产业面临的迫切任务。天然产物的抑菌效果受到了广泛关注，特别是黄酮类化合物[10]。黄酮类化合物的结构非常复杂，人工合成十分困难，因此如何充分利用我国丰富的植物资源，并利用从中提取的黄酮类化合物抑菌已成为各国研究的热点[11]。该研究测定紫苜蓿不同极性溶剂的提取物黄酮含量，并对紫苜蓿不同极性提取物的抑菌活性作了研究，以期为开发天然药物提供借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫苜蓿于2013年5月30日采自昆明官渡区小哨云南省草地动物科学研究院牧草资源圃，经云南省草地动物科学研究院李乔仙老师鉴定为豆科（Legumi-nosa）草本植物苜蓿属紫苜蓿（M.saliva L）。

供试菌株由西南林业大学林学院保护生物学系植物病理学实验室提供，见表1。

芦丁（购自中国食品药品检定研究院，分子式CHO₁₆，含量为92.5%），乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿试剂均为分析纯。

1.2 黄酮含量的提取及测定

1.2.1 样品的制备。取紫苜蓿地上部分，阴干后粉碎样品778g，用80%乙醇提取，50℃水浴回流提取，得浸膏150g;再将浸膏加适量水悬浮，用石油醚萃取得浸膏26g，用氯仿萃取得浸膏4g，乙酸乙酯萃取得浸膏4g，水相为116g。

1.2.2 标准曲线的制作。按照操作步骤（图1），在510nm波长下使用分光光度计测定各标准溶液吸光度（A），绘制芦丁的标准曲线，求出吸光度值A与芦丁的标准溶液浓度（C，mg/mL）之间的线性回归方程[12]。

1.2.3 黄酮含量测定。按照操作步骤（图2），称取石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相4部分供试样品，并用80%乙醇溶解在容量瓶中，再分别取出各部分供测样品，加入容量瓶中，分别精确加入5%NaNO₂溶液，摇匀：静置6min，加入10%AI（NO₃）₃溶液，摇匀;静置6min;再加入4%NaOH溶液，用80%乙醇定容，得待测溶液。

1.3 抑菌试验

利用抑菌圈法测定紫苜蓿地上部分各提取物的抑菌效果[13]：將约20mL牛肉膏蛋白胨培养基倒人培养皿制成平板，冷却凝固后分别加入5种菌悬液（菌悬液浓度调整为106CFU/mL）各200μL，均匀涂布于培养基表面[14]，取直径6mm无菌滤纸片，充分浸泡于紫花首蓿提取物中，水相（0.1406g/mL），乙酸乙酯相（0.0112g/mL）、氯仿相（0.064g/mL）、石油醚相（0.0612g/mL），取出后放在上述含菌平板上，每皿1片对照（生理盐水作对照），每种菌平行作3皿。37℃倒置培养18～24h后，分别测量各样品抑菌圈直径（mm）。

利用二倍梯度法测定最低抑菌（MIC）浓度[15]。对具有明显抑菌效果的紫苜蓿提取物样品进行连续二倍梯度稀释，后取1mL加到19mL的培养基中，混匀制成平板，均匀涂布上述5种菌（菌悬液浓度调整为106CFU/mL）各200μL，于37℃培养24h后，观察菌落生长情况。以完全无菌生长的提取物浓度做为供试样品溶液的MIC值，同时以1.0mL无菌生理盐水代替样品溶液与培养基混合作对照。

2 结果与分析

2.1 紫苜蓿的处理以及所得率

紫苜蓿粉碎样品778g，用80%乙醇溶液回流提取得浸膏150g;乙酸乙酯、石油醚、氯仿、水溶液部分的所得率分别为2.7%、17.3%、2.7%、77.3%。

2.2 黄酮含量的提取及测定

2.2.1 芦丁标准曲线。吸光度值A与芦丁标准溶液浓度（C，mg/mL）之间的线性回归方程为A=9.89C-0.0173（R²=0.9998）。分析表明，芦丁质量浓度在0.010～0.050mg/mL时与吸光度值具有良好的线性关系（图3）。

2.2.2 黄酮含量测定。按照标准曲线及其换算关系，计算紫苜蓿提取物各部分的黄酮含量（见图4），石油醚相的黄酮含量为3.47%，氯仿相的黄酮含量为14.49%，乙酸乙酯相的黄酮含量为9.13%，水相的黄酮含量为0.43%。

2.3 抑菌效果

通过抑菌圈法得知，紫苜蓿浸膏提取物除乙酸乙酯相对5种供试细菌有抑制作用外，其它相（石油醚相、氯仿相、水相）对5种供试细菌的抑制作用不明显（图5）。由表2可知，紫苜蓿的乙酸乙酯部分（3.5mg/mL），对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌直径分别为11mm、10mm、5mm、8mm、13mm。对乙酸乙酯相进行连续梯度稀释（乙酸乙酯相0.24g/mL、0.16g/mL、0.08g/mL、0.04g/mL、0.02g/mL和0.01g/mL），后加入牛肉膏蛋白胨固体琼脂培养基，待凝固后备用。以乙酸乙酯萃取物的MIC值分别为12mg/mL、8mg/mL、12mg/mL和1mg/mL，水溶物的MIC值分别为8mg/mL、4mg/mL、4mg/mL和2mg/mL。乙酸乙酯相的最低抑菌（MIC）对枯草芽抱杆菌为1.5mg/mL，对普通变形杆菌为1.5mg/mL，对大肠杆菌为3.0mg/mL，对铜绿假单胞菌为2.0mg/mL，对金黄色葡萄球菌为2.5mg/mL。

紫苜蓿乙酸乙酯相对枯草芽抱杆菌和普通变形杆菌抑制效果较为明显，对其他菌的抑制作用由大到小依次为：铜绿假单抱菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。

3 结论与讨论

近年来，人们对天然植物成分的开发与利用已成为研究热点，人们普遍倾向于从植物中提取有效成分进行研究。刘晓曼[16]研究了紫茎泽兰中倍半萜化合物对病原真菌有较高的抑菌活性，其最低抑菌浓度分别为0.1mg/mL和0.5mg/mL;陈佳佳[17]等采用琼脂打孔法研究了不同溶剂的桑叶提取物对5种常见食源性污染菌都具有较好的抗菌活性。紫花苜蓿是迄今发现对人体健康营养最全面的植物之一，作为潜在的健康食品来源备受关注。苏效双等[18]通过体外细胞实验，发现苜蓿黄酮可以提高细胞的抗氧化能力。Pietrzak等[18]现苜蓿提取物能显著改善血脂参数，降低胆固醇水平和降低低密度脂蛋白;左晓听等[20]研究表明，苜蓿黄酮化合物能抑制细胞增殖，同时苜蓿的皂苷与皂苷元具有防癌抗癌功效也得到证实。苜蓿具有巨大潜在开发价值，可能成为具有治疗耐药性病原体的抗菌化合物重要来源之一[21]。

本研究采用不同极性溶剂对紫苜蓿所含黄酮含量进行提取，并测定其含量占比，根据分光光度法测定，表明紫苜蓿含有较高的黄酮类化合物，石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯和水相的黄酮含量分别为3.47%、14.49%、9.13%和0.43%，各个萃取部分黄酮含量差异比较显著，氯仿相和乙酸乙酯相的黄酮含量较高，表明紫苜蓿的黄酮主要集中在中等极性部分[12]。后期使用抑菌圈法对紫苜蓿不同极性提取物的抑菌活性作了初步研究，结果表明，乙酸乙酯提取物对5种供试菌株具有明显的抑菌活性，其它相均没有明显的抑菌效果，说明其乙酸乙酯相具有潜在的广谱抗细菌特点。该研究为进一步开展紫苜蓿植物化学成分研究，并具体分离鉴定其抗菌活性成分奠定了基础，为该植物资源的合理利用提供了借鉴依据。（收稿：2018-12-06）

参考文献：

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