一株甘蓝内生枯草芽孢杆菌16S rDNA序列的克隆与分析

蒋 明，朱 欣，杨如棉，邬张颖，应梦豪，马佳莹，王佳怡，张慧娟

(台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000)

芽孢杆菌属(Bacillus)细菌隶属于芽孢杆菌科，广泛分布于自然界，种类十分丰富，在《芽孢杆菌文献研究》中记载了244种，并不断有新种发现的报道[1-4]。常见的芽孢杆菌属细菌包括巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等，在工业、农业、医学、食品及环保等行业得到广泛应用[5-8]。其中，枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，芽孢呈椭圆至圆柱状，能还原硝酸盐，是一种好氧细菌[5]。枯草芽孢杆菌的应用和研究已有100多年的历史，在农业上，枯草芽孢杆菌常用作植物病害的生防菌[9]。枯草芽孢杆菌V26用于防治由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的马铃薯黑丝菌病，具有良好的生防效果[9]；枯草芽孢杆菌HK-CSM-1防治人参炭疽病(Colletotrichumpanacicol)具有很好的效果[10]。

细菌鉴定的方法有形态学、生理生化和分子鉴定等，形态学和生理生化反映细菌的表型性状，易受外界环境及菌体生理状态的影响，而分子鉴定则不受内外环境的干扰，鉴定结果更具科学性和重演性[11]。5S rDNA、23S rDNA和16S rDNA是细菌核糖体的3个编码基因，其中，16S rDNA由于长度适中，兼有保守区和可变区，能提供足够的多态性，目前已广泛应用于细菌的分子鉴定和分类研究[12-15]。16S序列在枯草芽孢杆菌的鉴定上也有应用，LOTFY W A等[16]利用16S结合形态和生化鉴定，鉴定出一株产邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的枯草芽孢杆菌；SUBBA REDDY GANGIREDDYGARI等[17]从土壤中分离到一株可降解有机磷杀虫剂喹硫磷的细菌，经测定16S DNA序列，鉴定为枯草芽孢杆菌。台州学院生命科学学院实验室前期从甘蓝健康植株中分离到一株内生细菌GL06，经形态和生理生化鉴定，初步判断为枯草芽孢杆菌，该菌对根肿菌有一定的防治效果。笔者以枯草芽孢杆菌GL06为材料，利用PCR法克隆16S序列，并比对分析，以期为后续研究该菌的功能和开展生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌GL06，为甘蓝内生菌，该菌分离自甘蓝健康植株的叶柄组织，经鉴定后保存于台州学院生命科学学院实验室，该菌革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，无荚膜，能产生柱状芽孢；菌落表面粗糙，边缘不规则。细菌基因组 DNA 提取试剂盒，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。DNA凝胶回收试剂盒，购自上海碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌GL06的DNA，操作根据其提供的说明书进行。DNA经电泳检测后，置于-20℃保存。

1.2.2 16S rDNA序列的克隆 采用PCR法克隆枯草芽孢杆菌16S rDNA序列，上、下游引物分别为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(27F)和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(1492R)。PCR反应体系20 μL：10×PCR缓冲液2 μL，模板DNA 20 ng，dNTPs(10 mM)0.45 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，加ddH2O至终体积。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃ 变性30 s，55.5℃退火45 s，72℃延伸2 min，共32个循环；72℃最后延伸10 min。

1.2.3 PCR产物的回收、连接和转化 PCR扩增结束后，产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。用洁净的刀片割取含目的条带的胶块，置于1.5 mL无菌离心管中，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA片段。取3 μL回收产物与2×Rapid Ligation Buffer 5 μL、pGEM-T Easy载体(Promega)1 μL和T4DNA连接酶1 μL混合，置于4℃连接过夜。用热激法导入Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)。经涂布平板，挑取白色单菌落于37℃振荡培养12 h，经菌液PCR鉴定后，挑取3个阳性克隆用于测序。菌液PCR反应体系与程序同16S rDNA序列的克隆，模板DNA改为0.5 μL菌液。

1.2.4 16S rDNA序列比对分析 序列相似性比较在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库进行，从NCBI数据库下载10种芽孢杆菌属细菌的16S序列，分别是凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(KJ148634.1)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)(NR_043401.1)、细胞毒素芽孢杆菌(B.cytotoxicus)(NR_074914.1)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(NR_041455.1)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)(NR_043403.1)、韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)(NR_024697.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)(NR_074540.1)、环状杆菌(B.circulans)(EU733231.1)、简单芽孢杆菌(B.simplex)(NR_042136.1)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(NR_112116.2)。去除两段多余序列后用Mega软件构建系统发育树，建树方法为邻接法。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA序列的克隆

以27F和1492R为上、下游引物，从枯草芽孢杆菌GL06基因组DNA中扩增到16S序列。该片段的大小约1 500 bp，条带清晰、单一，无明显的杂带(图1)。经割胶、回收后，得到高纯度的回收产物，用于与载体的连接。

注：M为DNA分子量标准；1～4为枯草芽孢杆菌GL06基因组16S rDNA的PCR产物。Note: M,DNA marker; 1-4,PCR products of 16S rDNA in genome of B. subtilis strain GL06.

2.2 序列比对

经测序，3个阳性克隆的16S rDNA序列完全一致，长度均为1 510 bp(图2)。GL06 16S序列中A、T、C、G的比例分别是24%、22%、31%和23%，GC值为54%。该序列与NCBI数据库中枯草芽孢杆菌(NR_112116.2)16S序列的相似性最高，达99%，仅存在3个碱基差异；与解淀粉芽孢杆菌(NR_041455.1)的相似性次之，达98%；与其余芽孢杆菌属的相似性为93%～94%。

经多序列比对，GL06 16S与其他16S相比，序列上存在插入/缺失及转换和颠换现象。与环状杆菌16S相比，GL06 16S在46位存在插入现象；与巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌和细胞毒素芽孢杆菌的16S相比，在47位存在1个碱基缺失；与巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌和细胞毒素芽孢杆菌比较，GL06 16S在3位存在C↔T转换现象，在48位发现A↔T颠换(图3)。11条序列中，共有201个可变位点(Variable site)，其中，简约性信息位点(Parsimony-informative site)135个，单态突变位点(Singleton variable site)66个。

注：单下划线为上游引物27F，双下划线为引物1492R的反向互补序列。Note: Single underline,forward primer 27F; Double underline,reverse complement sequence of primer 1492R.

图3 枯草芽孢杆菌GL06及其同源序列的多重比对Fig.3 Multiple comparison in 16S rDNA sequence between B. subtilis strain GL06 and its homologous sequences

2.3 系统发育树

芽孢杆菌属11个菌株总的遗传距离为0.055，GL06与枯草芽孢杆菌的遗传距离最小，仅0.001；与简单芽孢杆菌的遗传距离最大，为0.070。从图4看出，11个菌株在系统发育树上可分为4组，GL06与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌聚于组IV，支持率为100%；苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌处于同一分支，再与细胞毒素芽孢杆菌聚于组I，支持率为100%；环状杆菌、简单芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌聚于组Ⅱ；凝结芽孢杆菌单独位于组Ⅲ。

3 结论与讨论

目前，细菌的鉴定方主要有传统的形态学观察、血清型鉴定、毒力测试、生化测定、仪器自动化鉴定和分子鉴定等[18]。分子鉴定方法有GC含量测定、DNA-DNA分子杂交、指纹图谱和16S序列分析等，此外，RNA 聚合酶的σ因子(rpoD)基因和促旋酶B亚基(gryase，gryB)基因在细菌分类和检测中也有一定应用[19-20]。rpoD、gryB等持家基因具有较快的进化速率，不同物种间的序列差异显著，而且分辨能力高，目前已应用于细菌的鉴定和系统发育研究[21-23]。盛强等[20]利用16S、gryB和rpoD等对辣椒(Capsicumannuum)一种新的细菌性叶斑病病原菌进行了鉴定，初步判定为黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)；卢佳琦等[24]结合16S和gryB对一株从凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)活菌片中分离的细菌进行鉴定，该菌与标准菌株的序列相似性达100%，明确该菌株为蜡样芽孢杆菌。

在分子鉴定方法中，对16S序列进行克隆、测序和比对，是目前鉴定细菌最为常用的方法。利用引物27F和1492R可扩增出约1 500 bp的片段，该序列具高度保守、中度保守和高度可变化的区域，可用来研究进化距离不同的细菌之间的关系和鉴定[25-26]。本研究利用通用引物从一株甘蓝内生枯草芽孢杆菌中克隆到长度为1 510 bp的片段，其序列大小与NCBI数据库中枯草芽孢杆菌(NR_112116.2)完全一致，但在序列组成上存在个别碱基的差异。BOSSHARD P P等[27]研究认为，相似率>99%可定义为种，结合前期的形态学和生化鉴定结果，确定GL06是枯草芽孢杆菌。陈美琪等[28]从健康鲈鱼中分离出一株细菌，其16S rDNA基因序列与枯草芽孢杆菌的相似性达99%，因此确定该种为枯草芽孢杆菌。吕美云等[29]从豆豉中分离到5株产纤溶酶的细菌，通过测定16S序列，其中，有2株与枯草芽孢杆菌的相似性达99%，认定2株细菌为枯草芽孢杆菌。同属细菌之间的16S序列通常十分接近，一般认为，16S rDNA相似性为95%～99%可确定为同属，但GL06菌株除与枯草芽孢杆菌(NR_112116.2)和解淀粉芽孢杆菌(NR_041455.1)外，与其余8种芽孢杆菌属菌株间的相似性低于这个范围，与严婉荣等[30]的研究结果一致。

以甘蓝内生菌枯草芽孢杆菌GL06为材料，利用通用引物进行PCR扩增，获得该菌的16S rDNA。GL06菌株16S序列的GC含量为54%，与来自NCBI数据库的枯草芽孢杆菌16S相似性高达99%，仅存在3个碱基的差异。芽孢杆菌属11个菌株(GL06、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、细胞毒素芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、环状杆菌、简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)在发育树上可分为4组，其中，GL06与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌聚为一组。甘蓝内生枯草芽孢杆菌GL06菌株16S rDNA的克隆与序列分析，为后续该菌的功能研究和生产应用奠定了基础。