茶多酚提取与纯化方法及其功能活性研究进展

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(1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025;2.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;3.贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳 550025)

茶叶是以山茶科植物茶(Camelliasinensis(L)O.Kuntze)的芽、叶为原料制成的产品,它与咖啡、可可并称世界上三大无酒精饮料。茶叶中含有丰富的功能性物质,如茶多酚、茶多糖、维生素及矿物质等[1],因此茶叶具有兴奋、抗衰老、醒酒、助消化、利尿、抗癌变、杀菌和解毒等功效[2-7]。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是茶叶中酚类化合物及其衍生物的总称,主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表儿茶素(epicatechin,EC)及儿茶素(catechin,C)等[8]。研究表明,茶多酚具有广泛的药理作用,如减肥、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗癌、抗骨质疏松、抗炎抑菌、抗放射损伤等[9-10]。目前,国内外常用的茶多酚提取方法主要有:溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法、酶提取法、超临界萃取法等[11-15],茶多酚的纯化方法主要有:树脂吸附法、膜过滤法、离子沉淀法等[16-18]。本文简要介绍了茶多酚的组成及其基本理化性质,并分析了茶多酚常用的提取方法、纯化方法、生物活性等,以期为茶多酚资源的有效开发利用及深入研究提供理论参考。

1 茶多酚的组成及性质

茶多酚(Tea Polyphenols,TP)又名抗氧灵、维多酚、防哈灵,是茶叶中所含的一类多羟基类化合物,由大约30多种含酚基的物质组成,包括黄烷醇类(儿茶素类)、黄酮醇类(黄酮醇及其苷类)、黄酮类(花黄素)、羟基-4-黄烷醇类、花青素类、缩酚酸类和酚酸以及其他多酚类[19]。其中儿茶素在茶叶茶多酚中含量最高,其又称为单宁、茶蹂酸、茶靴质,在茶叶干物质含量中占20%～35%。根据儿茶素分子结构特点可分为:表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食儿子茶素没食子酸酯(EGCG)4种主要物质[20],其结构式如图1。

图1 茶多酚中儿茶素单体结构式Fig.1 Structural formula of catechin monomer in tea polyphenols

在常温下,茶多酚为淡黄至茶褐色略带茶香的水溶液、粉状固体或结晶,但是在提取过程中,茶多酚很容易发生氧化或者聚合反应,因此通常见到的茶多酚都呈淡黄色至褐色,带有涩味,略带茶香;茶多酚易溶解于水、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等溶剂中,微溶于油脂中,不能溶解于苯及氯仿等有机溶剂中;耐热性及耐酸性好,在pH达到2～7时较为稳定,但在pH>8和光照下易发生氧化聚合,可与铁离子反应生成绿黑色化合物[21]。

2 茶多酚的提取方法

2.1 溶剂浸提法

溶剂浸提法是利用茶多酚在溶剂中溶解度不同来提取茶多酚的一种方法。茶多酚既可以溶解在水相中,又可以溶解于有机溶剂中,常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯等,但它不溶于氯仿、石油醚。该方法先用水或有机溶剂把茶多酚从茶叶中提取出来,然后用氯仿除去杂质,再用乙酸乙酯将茶多酚从水或有机溶剂提取物中分离出来,最后将乙酸乙酯回收,即得茶多酚粗品。目前采用溶剂浸提法提取茶多酚的各工艺中,主要在提取时所选择的提取剂、料液比、提取时间、提取液的pH、温度、提取次数等方面存在不同。溶剂浸提法提取茶多酚的工艺比较见表1。

表1 溶剂浸提法提取茶多酚的工艺比较Table 1 Comparison of process for extracting tea polyphenols by solvent extraction

溶剂浸提法提取茶多酚的优点是设备简单、成本低廉、操作简单;但提取时间较长、提取效率低、提取出的茶多酚容易被氧化、纯度低,后期必须反复除杂、精制,所用溶剂量大,部分溶剂有毒性、不利于食品安全,因而不易被食品、医药等行业所接受。而且后期除杂、精制过程繁杂,常涉及乙酸乙酯萃取,操作过程易产生乳化,导致产率下降。因此,溶剂提取法提取茶多酚,还需在简化除杂、精致工艺及提高提取率等方面加以改进。

2.2 超声波提取法

茶多酚主要存在于茶叶细胞原生质体及液泡内,细胞壁阻碍了茶多酚从细胞内向外渗出。超声波可与媒质产生相互作用,产生热作用、机械作用和空穴作用,在一定程度上破坏细胞壁结构,使细胞内物质快速溢出[29-31]。再用传统工艺从提取液中得到茶多酚,然后纯化。工艺过程为:茶叶→溶剂提取→超声波处理→分离→粗品茶多酚→纯化。超声波提取法提取茶多酚的工艺比较见表2。

表2 超声波提取法提取茶多酚的工艺比较Table 2 Comparison of the process of extracting tea polyphenols by ultrasonic extraction

利用超声波法提取茶多酚具有以下优点[37-39]:提取工艺流程比较简单,溶剂回收率较高,提取温度较温和,避免茶多酚在长时间高温下氧化的可能,提高了浸提效果,节约能源等。同时超声波辅助提取操作简便易行、能较好地保护茶多酚类成分的物理结构和生理活性。另外超声波提取法避免了有害溶剂的使用,提取成本低,综合经济效益显著,因此超声波提取法具有良好的市场前景和推广价值。

2.3 微波提取法

微波提取是指在微波场中,使用合适的溶剂从天然植物、动物组织、矿物等中提取分离各化学成分的技术方法[40]。微波提取的基本原理是:不同物质吸收微波的能力存在差异,在微波作用下,被作用基体物质的部分区域或萃取体系中的某些成分被选择性加热,使得被萃取物质与基体或体系分离,进入到微波吸收能力较差的萃取剂中[41]。微波提取技术具有加热迅速、选择性加热、高效节能、易于控制、安全环保、伴随产生生物效应等优点。微波提取法提取茶多酚的工艺比较见表3。

表3 微波提取法提取茶多酚的工艺比较Table 3 Comparison of the process of extracting tea polyphenols by microwave extraction

微波提取与传统提取法相比大大缩短提取时间,减少茶多酚的氧化,因此可有效保护原料中的活性成分。该法以水或乙醇为溶剂,环境友好无污染,提取率高,节约了溶剂,大大提高了提取效率,避免使用有毒溶剂,产品安全。

2.4 酶提取法

近年来,利用酶法提取生物活性物质的报道越来越多,酶不仅具有专一性和高效性的特点,同时作用条件温和,这样有利于生物活性成分的保留,另外无生物毒性,无污染,符合安全食品、绿色工业的时代要求,因此越来越受到人们的关注。果胶酶、纤维素酶等可软化或分解植物细胞壁,促进胞内成分流出,增加待提取物与提取剂接触机会,有效提高待提取生物活性成分的提取率[45]。酶法提取还常与其他技术联用,做到更快更高效地提取出生物活性物质。酶法提取茶多酚的工艺比较见表4。

表4 酶法提取茶多酚的工艺比较Table 4 Comparison of enzymatic extraction of tea polyphenols

在生物活性物质提取新技术中,添加酶可以有效地提高生物活性物质的得率,缩短提取时间。酶法提取的溶剂大多是水,避免了有机溶剂对人体的有害作用,可以安全有效地投入食品、保健、医药等方面的使用。该法在生物活性物质提取的应用中有着广阔前景。

2.5 其他方法

除以上提取方法外,茶多酚的提取还有其他方法,比如:高阳等[15]以3种茶叶(绿茶、青茶、红茶)为研究对象,利用复合酶进行预处理,并使用超临界CO2技术萃取,通过单因素试验确定最佳提取条件,结果表明,最佳条件为萃取温度50 ℃、萃取压力40 MPa、夹带剂(70%的乙醇)用量10%、萃取时间2.0 h,3种茶多酚粗品得率分别为14.2%、14.4%、11.1%。此外,还有采用微波-超声辅助双水相体系对绿茶末中的茶多酚进行提取[50]、微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取绿茶中的茶多酚[43]、生石灰水沉淀法[51]等的相关报道。

综上所述,原料不同导致提取率不同,不同提取方法得到的提取率不同。溶剂法提取设备简单,操作简单,成本低,但提取时间较长,提取效率低,提取出的茶多酚容易被氧化,所用溶剂量大,提取的茶多酚纯度较低,甚至茶多酚中还伴有大量的杂质。超声波提取法提取工艺流程比较简单,溶剂回收率较高,提取温度较温和,减少浸提时间,避免茶多酚长时间在高温下发生氧化,提高浸提效果,节约能源等。微波提取法大大缩短提取时间,茶多酚氧化减少,因此可有效保护原料中的活性成分。酶法提取有利于茶多酚活性成分的保留,同时缩短提取时间,且无生物毒性,无污染,符合食品安全、绿色工业的时代要求。

3 茶多酚的纯化方法

通过以上提取方法提取得到的茶多酚含有色素、茶多糖、茶蛋白等杂质,不利于后续的研究,要想得到高纯度的茶多酚,需要经过进一步的纯化。目前,通常使用的纯化方法有:树脂吸附法、膜过滤法、离子沉淀法等。

3.1 树脂吸附法

树脂吸附法是利用树脂对茶多酚的选择性吸附作用,实现与其他成分的分离,从而达到纯化茶多酚的目的。如牛志平等[16]以8种树脂对茶叶提取液的吸附解吸效果,筛选出最适合茶多酚分离纯化的CG-8树脂,当茶多酚供试液浓度为10 mg/mL,水洗液(2BV),用70%乙醇(2.5BV)解吸,澄清度为70.90%时,得到的产品茶多酚含量为98%,产品得率为85.8%。张斌等[52]采用正交试验确定了NKA-9树脂对茶多酚吸附分离的最佳工艺,在此工艺条件下分离得到的茶多酚含量为58.7%,得率为14%。连志庆[53]采用树脂LX-7吸附茶浓缩液的茶多酚,经过吸附分离,最后得到的茶多酚含量为91.35%,得率为9.65%。该方法工艺简单,耗能少,无毒,因此为茶多酚在食品、医药等方面的应用提供安全保障,而且树脂可以回收利用,符合环保发展理念。但该方法对树脂质量、性能的要求比较苛刻,树脂的成本较高,寿命较短,需要定期换新,因此只适合小规模试验,不适宜大规模工业化生产。

3.2 膜过滤法

膜过滤法[54]是根据分子量的大小不同,在茶多酚分离纯化中使溶液中的茶多酚等小分子选择性地通过膜,一定程度上将茶多酚、咖啡碱等与蛋白质、果胶、可溶性淀粉等进行了分离,从而提高茶多酚的含量。袁林颖等[17]采用中空纤维膜超滤,大孔吸附树脂分离纯化茶多酚,低压下抽真空干燥,得到纯度高于95%、咖啡因含量低于1%的茶多酚。周义卉等[55]采用截留分子量为100 kDa的超滤膜来过滤速溶茶副产品,通过正交试验确定其最优工艺为:样液质量分数0.40%、温度35 ℃、压力0.138 MPa,在此条件下得到的茶多酚含量为48.73%,得率为40.75%。Chandini[56]等通过试验优化处理,表明在料液浓度为0.6%,采用MF-450 nm过滤得到的滤液中茶多酚含量为76.3%。该方法操作简单、方便,不需要有机溶剂和加热处理,条件温和,环境污染小,过滤得到的茶多酚活性较高。但膜易受外界杂质污染,过滤速度慢,此外膜的使用寿命是一个值得关注的问题。

3.3 离子沉淀法

离子沉淀法是根据茶多酚能与某些金属离子(如Al3+、Ca2+、Mg2+等)形成络合物而沉淀,从而将茶多酚从复杂的混合物中分离出来,达到纯化的目的。余兆祥等[57]以Al3+和Zn2+为复合沉淀剂,对茶多酚初提液进行分离纯化,结果茶多酚的提取率为10.4%,纯度为96%。孙志栋等[58]采用金属离子沉淀法对茶多酚进行分离纯化,茶多酚的提取率为11%～30%,纯度为96%。王凯博等[18]用硫酸铝和硫酸锌作为沉淀剂对茶多酚进行分离纯化,得到的茶多酚纯度为94.3%。李石敬敏等[59]以干燥绿茶粉末为原料,采用超声-离子沉淀法提取茶多酚,得到的茶多酚纯度最高可达99.80%。该方法选择性强,工艺简单,成本低,产品色泽好,水溶性好,产品纯度高。但茶多酚在相转化过程中容易被氧化,某些有毒金属离子在产品中有残留,对设备耐腐蚀性较高。

3.4 其他方法

除以上纯化方法外,陈理等[60]利用高速逆流色谱法对茶多酚中两种儿茶素进行了分离纯化,最终得到了纯度高达98%的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)。此外,还有柱色谱法[61]、高效制备液相色谱[62]等方法已有报道。

4 茶多酚的生物活性研究

目前,国内外许多学者对茶多酚的关注主要在抗氧化作用、抗肿瘤作用、抗辐射作用和抗动脉粥样硬化作用等方面。

4.1 抗氧化作用

茶多酚是一类含有多酚羟基的化学物质,结构中的羟基可提供活泼的氢从而使自由基灭活,因此具有较强的抗氧化活性。陈丹丹等[63]研究证明,茶多酚有着极强的羟自由基和DPPH自由基清除能力。王丹丹等[64]以带鱼为研究对象,研究不同质量浓度茶多酚对带鱼的抗氧化效果,结果表明经茶多酚处理后能够有效减缓蛋白质、脂肪等氧化分解。冯丽琴等[65]研究茶多酚的体外抗氧化性,结果表明粗茶多酚和儿茶素单体对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基存在很强的清除作用。刘唤明等[66]研究表明,茶多酚对细胞氧化溶血和H2O2所致的氧化溶血有显著的抑制作用。表明茶多酚可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和医药工业中。

4.2 抗肿瘤作用

大量试验研究表明,茶多酚具有抗肿瘤的功效。对于机体而言,致癌因子多为人类身体内的代谢反应产生的自由基,如反应氮、氧自由基等,这类自由基会对DNA的功能、结构加以破坏,最后导致了细胞的突然变化、病变死亡等。而茶多酚是一种低毒、高效的自由基消除剂,对细胞的DNA断裂可以起到非常好的抑制作用,可以阻断氧化。石芳等[67]研究表明,多酚类化合物主要通过激活癌细胞的调控凋亡的基因,诱导癌细胞的凋亡。Helieh等[68]研究表明,茶多酚在400～800 mg/mL能够诱导DNA片段化,并与剂量相关,高浓度的茶多酚(>800 mg/mL)能够导致肿瘤细胞凋亡和细胞溶解。Sagara等[69]研究表明,茶多酚通过阻滞癌细胞血管生成进而影响癌细胞生长,从而对治疗膀胱癌具有很好的疗效。Hajiaghaalipour等[70]研究表明,白茶提取物通过激活Caspase-3,-8,-9而发挥抗肿瘤活性,在抗结肠癌细胞活性方面具有功效。Huang等[71]研究表明,茶多酚-锰和茶多酚均能诱导癌细胞凋亡,且茶多酚-锰诱导癌细胞凋亡的细胞凋亡率比茶多酚高出2倍以上。

4.3 抗辐射作用

茶多酚抗辐射作用是通过调节基因表达,清除自由基以及蛋白合成等途径来完成的。Nair等[72]研究表明,在γ射线辐射前对白鼠进行灌服表儿茶素,可以防止由辐射引起的血液白细胞DNA裂解,从而起到抗辐射的作用。Peng等[73]利用小鼠研究茶多酚预防γ射线辐射损伤,结果表明,茶多酚灌服能够防止辐射诱导的小鼠下颌腺细胞凋亡,减少活体受到的辐射伤害。赵文红等[74]研究表明,茶多酚可以减少由于阳光紫外线所造成的皮肤损伤,对于紫外线所引发的光感性皮炎可起到抑制的作用,让其所造成的突变降到最低。郭绍来等[75]采用60Coγ射线照射小鼠造成亚急性损伤模型,结果表明,50%的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有明显缓解辐射所造成的造血功能损伤和抗氧化作用。

4.4 抗动脉粥样硬化作用

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)主要是以动脉壁上的脂质沉淀形成粥样状的病灶,以及纤维增生让管壁变得没有弹性所引发的,治疗的意义在于抑制低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)的氧化修饰。在Xie等[76]研究表明,在尿酸刺激人脐静脉内皮细胞建立的体外炎症模型中,茶多酚EGCG预处理后,能通过Notch信号通路,显著抑制血管内皮细胞中炎症因子单核细胞趋化蛋白1、IL-6和TNF-α的分泌,减少炎症因子对内皮细胞的损伤,进而起到防治心血管疾病的作用。李鸿飞等[77]通过建立动脉粥样硬化兔模型,结果表明,茶多酚能够抑制通过免疫调节机制抑制Ig G及Mφ在斑块内表达,并具有一定的量效关系。

4.5 其他作用

除以上活性研究之外,有研究发现,茶多酚可显著降低Ⅱ型糖尿病性脂肪肝模型大鼠肝脏中的甘油三酯,对胰岛素抵抗具有改善作用[78]。钟满群等[79]研究表明,茶多酚能够增加肥胖大鼠的血清活性,可以提高机体抗氧化能力,改善机体在低氧状态以及应激状态的炎症反应,因此茶多酚具有减肥作用。陈陶等[80]研究表明,茶多酚在不降低疼痛治疗效果的前提下,能有效改善小鼠肠蠕动预防吗啡所致便秘。此外,茶多酚还可作为一种新型的农药或植物生长促进剂在农业中使用,且对农作物有明显的增产和抗病虫害的作用[81-82]。

5 展望

近年来,伴随着国内外学者对茶多酚研究的日益重视,茶多酚的许多生物活性及功能逐渐进入人们的视野,国内外学者在茶多酚的化学成分、提取方法、纯化方法、抗氧化、抗肿瘤、抗粥样硬化等方面做了大量的研究。但是由于茶多酚本身化学成分的复杂性和生物功能的多样性,有必要借助先进的仪器设备对茶多酚化学成分进行进一步的鉴定研究,对化学成分与生物活性之间的联系也需要进一步研究。目前茶多酚的各种提取方法大多采用单一提取方法,并且对提取后得到的茶多酚没有进一步分离纯化,所以,得到的茶多酚的纯度不高,同时得率也比较低,此外使用部分有机溶剂提取得到的产品存在潜在危害,不利于用于食品、医药行业。因此,对于茶多酚的提取,应该采用多种提取方法联用,同时跟进对茶多酚的分离纯化,这样更有利于为茶多酚的工业化生产提供理论基础。茶多酚在抗氧化、抗肿瘤、抗粥样硬化等方面也倍受关注,但大多数研究仅限于实验阶段,还需进一步临床试验研究。

我国是茶叶种植大国,要想增加茶叶的附加值,对于茶多酚的提取工艺进行不断完善是必要的,同时,在提取茶多酚的过程中,应不断改进和完善茶多酚的稳定化技术,确保茶多酚的质量、活性,其应用前景将更加广泛,将促进其在工业、食品和医疗领域的开发和利用。