雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

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(北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京联合大学生物化学工程学院,北京 100191)

我国拥有历史悠久的酒文化,同时也拥有数量庞大的酒精消费人群,但长期大量饮酒会造成酒精性肝损伤,导致肝脏发生脂肪变性、炎症、坏死、纤维化或硬化等[1-4]。酒精对肝脏的损伤主要是由于酒精在机体内,通过引起氧化应激导致氧化产物增加,诱使脂肪在肝脏聚集,发生脂质过氧化反应和炎症反应,导致肝细胞进一步变成炎症、坏死、纤维化和硬化[5-7]。目前对于治疗酒精性肝损伤尚无特效药,通常通过补充一些具有抗氧化作用的药剂如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等可以减少酒精引起的氧化损伤,但其作用机制和副作用等尚未完全明确[4,8]。因此,开发安全有效的预防和治疗酒精性肝损伤的功能食品和药品具有重要意义。

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是一种淡水单细胞绿藻,隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属[9-10]。雨生红球藻有两种生长形态,适宜条件下(弱光和氮磷充足)以浮游的绿色营养细胞形式生长,但在不利环境下,则会形成一层厚壁孢子,同时细胞内则累积大量的类胡萝卜素,主要为虾青素[11-14],藻源虾青素是雨生红球藻的主要活性物质。研究表明,雨生红球藻能够通过抗氧化作用缓解运动大鼠的心肌损伤[12],白云[15]研究了雨生红球藻和维生素E联用对大鼠由急性酒精引起的肝损伤具有明显的保护作用,并指出其雨生红球藻中的虾青素的抗氧化作用是保护急性酒精肝损伤的主要物质。藻源性虾青素的抗氧化活性已被研究和证实。本研究拟通过建立酒精性肝损伤模型,从肝脏酶活性的变化、炎性因子含量以及肝组织病理切片方面,探讨雨生红球藻破壁孢子粉对酒精所致的小鼠酒精性肝损伤的保护作用,旨在为雨生红球藻的开发利用提供一定的理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明小鼠 维通梨利华实验动物有限公司,许可证编号:SCXK(京)2012-0001,SPF级,雄性,体质量(25±2) g;雨生红球藻破壁孢子粉 杭州鑫伟低碳技术研发公司提供;总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione peroxidase,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA) 南京建成生物工程所;小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)酶联反应测定试剂盒 上海沪尚生物科技有限公司。

UV-2450紫外可见分光光度计 日本津岛仪器有限公司;5804R型低温高速离心机 德国Eppendorf股份有限公司;7180型全自动生化分析仪 日本日立高新技术公司;电动匀浆器 常州朗越仪器制造有限公司;W201B水浴锅 上海申顺生物科技有限公司;cx23生物显微镜 日本奥林巴斯有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠酒精性肝损伤模型的建立 小鼠酒精性肝损伤模型建立是参考了周斌等[16]、以及储兰兰等[17]文献,再结合预实验结果,表明此种造模方式在本实验中效果较好。昆明种小鼠60只,小鼠适应性喂养5 d后,将小鼠随机分为正常对照组、模型组、雨生红球藻破壁孢子粉低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)高(400 mg/kg)剂量组,上述剂量是按照新资源食品对雨生红球藻的人体推荐量(0.8 g/d)进行设置,受试物采用双蒸水进行配制,每组12只。各剂量组每天经口灌胃受试物(20 mL/kg),正常对照组和模型组则给予等体积双蒸水。从实验第8 d开始,各剂量组先给予受试物,4 h后，各剂量组和模型组再分别给予50%乙醇,正常对照组则给与等体积双蒸水,连续7 d。

1.2.2 血清及脏器的采集与制备 末次灌胃后,各组小鼠断食不断水16 h。称重,摘眼球取血,血浆静置30 min后,于4000 r/min 室温离心15 min,分离血清置于1.5 mL 离心管中,4 ℃保存。之后小鼠颈椎脱臼处死后解剖,取肝脏,迅速用预冷的体积分数为0.9%生理盐水冲净表面浮血,滤纸拭干,称重,用于计算肝脏指数和各种生化指标。剪取肝左叶组织浸入体积分数为10%中性多聚甲醛中固定,用于制作石蜡切片,HE染色,于光学显微镜下检查组织病理学变化;剪取剩余部分肝组织用于制备10%肝脏组织匀浆液保存待测。

1.3 指标检测及方法

1.3.1 一般情况观察 在整个实验过程中,观察小鼠的体重变化、进食、毛发、状态、行为及死亡情况,有任何异常情况应作记录。

1.3.2 小鼠肝脏指数的计算 肝脏指数(%)=小鼠肝脏重量(g)/小鼠体重(g)×100。

1.3.3 生化指标的检测 采用全自动生化分析仪测血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的含量以及甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)的含量;按照试剂盒说明书进行肝匀浆中MDA、GSH含量以及SOD活性测定。

1.3.4 炎性因子检测 按照试剂盒说明书操作测定肝组织TNF-α和IL-1β含量。

1.3.5 肝脏病理学检查 取于10%中性多聚甲醛固定好的肝组织块,经酒精梯度脱水(70%、80%、90%、95%、100%的酒精各脱水30 min)、石蜡包埋、切片、染色之后,于光学显微镜下观察肝细胞的形态变化、炎症反应、纤维化、脂肪空泡等病理改变。

1.4 数据处理

采用SPSS 22软件对实验数据进行统计分析,实验结果以均值±标准差表示,显著性检验采用单因素方差分析。图片处理采用OringinPro 2017软件。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般观察结果

整个实验过程中,正常对照组小鼠在体重增长、进食状况、毛色光泽等方面表现正常,未出现中毒及死亡情况。灌胃酒精后,模型组小鼠和三个剂量组小鼠均开始表现出行走不稳、醉倒、嗜睡等现象,模型组小鼠醒酒时间较长,恢复较慢。实验中后期,模型组小鼠出现躁动不安、毛色暗淡甚至有轻微脱毛现象,各剂量组小鼠状态均有不同程度的改善,毛色也基本趋于正常。

2.2 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响

由图1可知,模型组小鼠的肝脏指数与正常对照组相比,肝脏指数极显著增加(p<0.01),与模型组相比,三个剂量组小鼠肝脏指数均极显著降低(p<0.01)。结果表明,长期给予小鼠酒精灌胃,会使小鼠肝脏发生肿胀现象,导致肝脏指数上升。而给予雨生红球藻破壁孢子粉干预,则能显著降低小鼠肝脏指数,减轻肝脏损伤,初步说明雨生红球藻具有一定护肝功能。

图1 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肝脏指数的影响Fig.1 Effects of Haematococcus pluvialis sporoderm-brokenspore powder on liver index in mice注:*表示与正常对照组比较差异显著(p<0.05),**表示与正常对照组比较差异极显著(p<0.01);#表示与模型对照组较差异显著(p<0.05),##表示与模型对照组比较差异极显著(p<0.01)。表1～表4同。

2.3 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性肝损伤小鼠血清ALT和AST含量的影响

ALT和AST作为两个非特异性细胞内功能酶,常用于临床上评价肝功能[18],机体正常时,其在血清中的含量很低,但当肝细胞受到损伤时,血清中ALT和AST含量会显著增加,所以ALT与AST水平的高低在一定范围内反映机体肝细胞的损伤程度[19]。由表1可知,与对照组比较,模型组小鼠的ALT浓度增加了17.42%,表现出显著性差异(p<0.05),而AST浓度则增加了31.61%,表现出极显著性差异(p<0.01),说明模型组小鼠肝脏受到损伤,而ALT升高不够灵敏,是因为乙醇使得该酶的活性辅助因子B6下降所致[20]。经过雨生红球藻粉干预的小鼠,与模型组相比,三个剂量组小鼠的AST含量均极显著下降(p<0.01),ALT有所下降,但是并未出现显著性差异,可能是由于即使肝脏受到损伤之后,ALT本身上升也不够灵敏所致。结果表明,雨生红球藻能够显著降低血清中AST的含量,减轻实验小鼠由酒精引起的肝损伤。

表1 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠血清ALT和AST含量的影响(U/L)Table 1 Effects of sporoderm-broken spore powder of Haematococcus pluvialis on ALT,AST content in mice serum(U/L)

2.4 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG浓度的影响

血清中TC和TG这两个指标与脂代谢密切相关,当肝脏脂肪过多或者肝脏脂肪代谢能力障碍时,TC和TG含量会随之升高[21]。由表2知,与正常对照组相比,模型组的TC、TG浓度显著升高(p<0.05),说明小鼠长期进行酒精灌胃,会导致肝脏TC、TG含量增加。与模型组相比,低剂量组TC水平极显著降低(p<0.01),中剂量和高剂量组则显著降低(p<0.05),表明低剂量的雨生红球藻粉即有显著作用。与模型组相比,各剂量组的TG浓度则未表现出显著性差异(p>0.05),表明雨生红球藻粉可能对于由酒精引起的肝脏TG水平的升高无明显降低效果,无论剂量高低。以上结果表明,雨生红球藻破壁孢子粉能够对由酒精引起小鼠肝脏TC、TG含量的增加具有良好的缓解作用。

表2 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠血清TC、TG含量的影响(mmol/L)Table 2 Effects of sporoderm-broken spore powder of Haematococcus pluvialis on TC,TG contents in mice serum(mmol/L)

2.5 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性肝损伤小鼠肝脏抗氧化作用的影响

表3 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肝脏MDA含量及SOD活力、GSH含量的影响Table 3 Effects of sporoderm-broken spore powder of Haematococcus pluvialis on MDA and GSH contents,SOD activity in mice liver

2.6 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肝脏炎性因子TNF-α和IL-1β含量的影响

肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1β是两个重要的促炎因子[26],小鼠体内在受到酒精长期刺激后,体内发生炎性反应,促炎因子的含量则会增加。由表4知,与正常对照组相比,模型组小鼠肝脏TNF-α和IL-1β浓度极显著增加(p<0.01),说明小鼠在长期酒精的作用下,小鼠体内发生了炎症损伤,导致肝脏炎性因子水平升高。与模型组相比,各剂量组的TNF-α均表现出下降,其中,中剂量组显著下降(p<0.05),高剂量组极显著下降(p<0.01),各剂量组的IL-1β含量与模型组相比,均极显著降低(p<0.01)。以上结果表明,雨生红球藻破壁孢子粉能够减轻小鼠由酒精刺激所致的炎症损伤,并且对IL-1β的清除效果更好。

表4 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肝脏TNF-α、IL-1β含量的影响(ng/L)Table 4 Effects of sporoderm-broken spore powder ofHaematococcus pluvialis on TNF-α,IL-1β contents in mice liver(ng/L)

2.7 雨生红球藻粉对小鼠肝组织病理学的影响

由图2可知,正常对照组小鼠肝细胞索结构清晰,以小叶中央静脉为中心呈放射状排列,肝小叶内网状纤维支架结构完整,分布规律,汇管区及其周围无炎症细胞浸润,肝细胞无明显的脂肪变性、水肿、坏死等,排列整齐(图2a);模型组小鼠肝小叶结构不清晰,细胞核被挤压至边界,肝索排列不规则,大量细胞边界模糊不清并出现坏死(图2b);低剂量组与模型情况类似,但可见的损伤程度明显减轻(图2c);高剂量组肝索排列较为整齐,组织结构趋于正常(图2d)。病理组织形态学观察提示:雨生红球藻对酒精所致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。

图2 雨生红球藻对小鼠肝组织病理的影响(HE,×200)Fig.2 Effects of Haematococcus pluvialis on pathological injury of mice liver注:a:正常对照组;b:模型组;c:低剂量组;d:高剂量组。

3 讨论与结论

自80年代对酒精性肝损伤发病机制深入研究之后,便已证实乙醇具有直接的肝毒性[27]。有新的研究表明,酒精性肝损伤主要来自于其代谢产物乙醛在体内积累所引起的各种氧化损伤,甚至会导致基因突变[28]。当体内乙醇过量时,一方面,代谢产物乙醛则能通过不同的途径对机体造成损伤;另一方面,乙醇也能直接刺激活性氧自由基的产生,对机体具有极强的攻击性[31]。与此同时,为拮抗体内过多的活性氧自由基,也会加快SOD和GSH的耗竭[32]。因此,通过增强体内代谢乙醇及其产物的酶的活性或是增强机体的抗氧化能力,对治疗酒精性肝损伤具有极其重要的意义。

实验结果表明,经雨生红球藻干预后,实验小鼠的肝脏指数显著降低,血清中ALT和AST含量显著降低,肝脏SOD活性和GSH含量显著增加,脂质过氧化物MDA含量显著降低,炎性因子TNF-α和IL-1β含量均显著降低,肝脏病理情况也得到明显改善。综上所述,雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肝损伤具有显著的保护作用,其作用机制可能与增强小鼠的抗氧化能力减轻炎症反应相关,具体的作用机制本实验室将继续研究,以期为雨生红球藻作为食品的开发利用提供理论依据。