响应面法优化超高压处理提取金银花绿原酸工艺

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(1.齐鲁工业大学(山东省科学院),山东济南 250000;2.山东上水农业发展股份有限公司,山东淄博 255000)

金银花(又名双花、忍冬花等)为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥花蕾或初开的花,味甘、性凉,主肺、心、胃经,具有清热解毒、疏风散热的功效,可用于治疗痈肿疔疮、咽喉麻痹、丹毒、热毒血痢、风热伤风、温热退热,药用历史悠久,有“中药抗生素”之称[1-2]。山东金银花产量居全国首位,对金银花进行深加工,丰富金银花产品种类,提高产品的附加值,可以带动当地经济发展。

绿原酸是金银花的主要药用成分[3],具有清热解毒和抗菌消炎作用[4],对消化道癌症具有明显的抑制作用,与人体血小板凝集和凝血因子的生成有关,还具有抗生育作用及对免疫系统的调节作用[5-6]。从金银花中提取绿原酸多采用水提法、醇提法、微波提取法、超声提取法等方法[8-9]。超高压提取技术是利用以上的流体静压力作用于溶剂和植物物料的混合液,保压几分钟后卸压,随后进行分离纯化,从而达到提取的目的。超高压提取技术具有提取得率高、耗时短、能耗低、提取液澄清、杂质含量少、常温下操作,保护热不稳定成分的活性、操作简单等优势。研究表明,超高压提取法同超声提取法、热回流提取法进行比较,超高压提取效果明显优于超声提取和热回流提取。本实验以金银花为原料,采用超高压处理金银花,研究压力、保压时间、提取时间等因素对金银花绿原酸得率的影响,提高金银花绿原酸的得率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花 山东上水农业发展有限公司;蒸馏水、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯 均为分析纯,济南市三新俐华公司;绿原酸标准品 北京索莱宝科技有限公司。

QJ32W1000A型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;AB135-S型电子分析天平 METTLER TOLEDO公司;RE111型旋转蒸发仪 瑞士BBCHI公司;SHB-Ш循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司;HPP/0.6L超高压设备 天津华泰森淼生物技术有限公司;XMTD-8222型真空干燥箱 济南龙瑞商贸有限公司;索氏抽提器 实验室组装。

图1 超高压设备及其结构图Fig.1 UHV equipment and its structure

1.2 实验方法

1.2.1 超高压处理金银花 将金银花鲜花在真空干燥箱(90 ℃,12 h)中干燥,用粉碎机粉碎为粉末。取适量的金银花粉末置于真空包装袋中真空密封,再将真空袋置于超高压设备中,设置压力和保压时间进行超高压处理。

1.2.2 金银花绿原酸的提取

1.2.2.1 绿原酸提取的工艺流程 金银花粉碎→索氏抽提→抽滤→浓缩→冷沉离心→真空冷冻干燥

1.2.2.2 操作步骤 称取经超高压处理的金银花粉末200.0 g,加入一定体积的一定浓度的乙醇浸泡12 h,用索氏提取器提取一定时间后,用真空抽滤装置进行抽滤,将滤液用旋转蒸发仪(40 ℃)减压浓缩。将浓缩液转移至分液漏斗中,加入适量的石油醚脱色处理2次,再用适量的乙酸乙酯萃取4次[7],以上步骤均取下层液体。将萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩,得到的浓缩液冷沉离心(4000 r/min,5 min),将下层沉淀真空冷冻干燥(30 ℃,24 h)得到金银花绿原酸提取物。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 提取压力对金银花绿原酸得率的影响 分别称取金银花粉末各200 g,置于真空袋中,设置压力为100、200、300、400、500 MPa,保压时间为10 min,超高压处理完后,固定提取时间2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇浓度60%(乙醇与水的比例为6∶4,下文同),提取得到绿原酸。

1.2.3.2 保压时间对金银花绿原酸得率的影响 分别称取金银花粉末各200 g,置于真空袋中,设置保压时间为5、7.5、10、12.5、15 min,压力为300 MPa,超高压处理完后,固定提取时间2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇浓度60%,提取得到绿原酸。

1.2.3.3 提取时间对金银花绿原酸得率的影响 分别称取金银花粉末各200 g,置于真空袋中,设置压力300 MPa,保压时间10 min,超高压处理完后,固定料液比1∶10 g/mL,乙醇浓度60%,分别对金银花粉末进行提取1、1.5、2、2.5、3 h,得到绿原酸。

常压下,料液比1∶10 g/mL,乙醇浓度60%的条件下,分别对金银花粉末进行提取1、1.5、2、2.5、3 h,得到绿原酸。

1.2.3.4 液料比对金银花绿原酸得率的影响 分别称取200 g金银花粉末,置于真空袋中,设置压力300 MPa,保压时间10 min,固定提取时间2 h,乙醇浓度60%,分别在料液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15 g/mL的条件下提取得到绿原酸。

常压下,固定提取时间2 h,乙醇浓度60%,分别在液料比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15 g/mL的条件下提取得到绿原酸。

1.2.3.5 乙醇浓度对金银花绿原酸得率的影响 分别称取200 g金银花粉末,置于真空袋中,设置压力300 MPa,保压时间10 min,提取时间2 h,料液比1∶10 g/mL,分别用乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇对金银花粉末进行提取,得到绿原酸。

常压下,固定提取时间2 h,料液比1∶10 g/mL,分别用乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇对金银花粉末进行提取,得到绿原酸。

实验重复三次取平均值。

1.2.4 超高压提取金银花绿原酸的响应面工艺优化 在单因素实验结果的基础上,以提取压力、保压时间、提取时间、液料比和乙醇浓度为考察变量,采用Box-Behnken试验设计方案,采用五因素三水平对工艺条件进行优化[10]。

1.2.5 金银花绿原酸含量的测定

1.2.5.1 标准曲线的绘制 称取绿原酸标准品10 mg,用无水乙醇溶解,定容至100 mL,分别取0、1、2、3、4、5、6 mL于7个25 mL容量瓶中,用无水乙醇定容。分别用分光光度计在330 nm处测吸光度。并以吸光度为纵坐标,绿原酸标准品质量浓度为横坐标绘制标准曲线[8-9]。

1.2.5.2 金银花绿原酸含量的测定 称取提取的绿原酸样品1 mg,用适量无水乙醇溶解,定容至25 mL,摇匀静置。用分光光度计在330 nm处测吸光值,计算绿原酸的含量及得率。

绿原酸得率(%)=根据标准曲线测得的含量/原金银花质量×100

1.3 数据处理

采用Origin 8 Pro SR4软件和Design-Expert软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取压力对金银花绿原酸得率的影响 从图2可以看出,随着提取压力的增加,金银花绿原酸的得率呈现先增大后减小的趋势,在提取压力为300 MPa时,得率达到最大值。这是由于金银花细胞在超高压条件下,细胞内外的巨大压力差会破坏细胞结构,提高有效成分的渗透速率和溶剂的扩散动力,从而使金银花绿原酸得率提高。但当压力超过300 MPa时,由于压力差过大,促使金银花细胞中的其他大分子物质渗透出(如蛋白质、色素等)造成溶质通道的堵塞,影响了金银花的提取效果,降低了金银花绿原酸的得率。因此,最适提取压力选择为300 MPa。

图2 提取压力对金银花绿原酸得率的影响Fig.2 Effect of extraction pressure on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.2 保压时间对金银花绿原酸得率的影响 从图3可以看出,保压时间在5～10 min时,金银花绿原酸的得率随着保压时间的增加而升高;当保压时间超过10 min后,得率基本保持不变。这是由于在巨大的压力下,金银花细胞内的有效成分的渗透速率和溶剂的传质速率迅速增加,当达到平衡后,渗透速率和传质速率不再增加,所以继续增加保压时间,金银花绿原酸的得率基本保持不变。因此,最适保压时间选择为10 min。

图3 保压时间对金银花绿原酸得率的影响Fig.3 Effect of holding time on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.3 提取时间对金银花绿原酸得率的影响 从图4可以看出,提取时间在1～2 h时,金银花绿原酸的得率随着保压时间的增加而升高;当提取时间超过2 h时,得率基本保持不变。这是由于在提取开始时,随着时间的增加,金银花中的有效成分不断扩散到溶剂中,当扩散达到平衡时,有效成分不再扩散,得率基本保持不变。所以继续增加提取时间,金银花绿原酸的得率基本保持不变。因此,最适提取时间选择为2 h。

2.1.4 液料比对金银花绿原酸得率的影响 从图5可以看出,在加压条件下,金银花绿原酸的得率在料液比1∶5～1∶10 g/mL时,随着料液比的增加而增大,料液比超过1∶10 g/mL时,绿原酸的得率基本保持不变。在常压条件下,金银花绿原酸的得率随着料液比的增加而提高,但加压条件下的提取率明显高于常压条件下的提取率。这是因为,随着料液比的增加,金银花细胞内有效成分的扩散速率不断增加,到料液比增大到一定量时,绿原酸扩散速率达到平衡,不再增加,继续增大料液比,传质动力不再增加,绿原酸的得率不再增大,且会造成提取溶剂的浪费。因此,选择1∶10 g/mL为最适料液比。

图5 料液比对金银花绿原酸得率的影响Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.5 乙醇浓度对金银花绿原酸得率的影响 从图6可以看出,在加压条件下,在乙醇浓度小于60%时,金银花绿原酸的得率随着乙醇浓度的增加而增大,在乙醇浓度为60%时达到最大值,当乙醇浓度大于60%时,金银花绿原酸的提取率呈下降趋势。这是由于当乙醇浓度较大时,一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的物质溶出量增加,这些成分与绿原酸竞争乙醇,从而导原绿原酸的得率降低。因此,选择60%为最适乙醇浓度。

图6 乙醇浓度对金银花绿原酸得率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

由图4～图6可以明显看出,加压条件下金银花绿原酸的得率明显高于常压下的得率,因此提取时需在加压条件下进行。

2.2 响应面优化试验

以金银花绿原酸提取率为响应值,在单因素实验的基础上,选取对绿原酸得率有明显影响的压力、保压时间、提取时间、料液比、乙醇浓度进行五因素三水平的响应面分析实验。

表2 Box-Behnken中心组合试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken center combination test

将实验数据用Design Expert软件进行多元回归拟合,得到以提取率为目标函数的回归方程:

Y=4.87+0.38A+0.28B+0.17C+0.11D+0.18E+0.22AB+0.13AC+0.11AD+0.073AE+0.12BC+0.033BD-0.19BE+0.042CD+0.048CE+0.070DE-0.59A2-0.47B2-0.47C2-0.37D2-0.25E2

表3 精油提取率响应面回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of essential oil extraction rate response surface regression model

根据回归方程作出相应等高线及其曲面图(见图7),列出的图为对绿原酸得率影响显著的因素的交互作用图,考察所拟合的响应曲面的形状,分析各因素对绿原酸得率的影响。由图7可知,压力与保压时间交互作用响应面图和等高线图中,曲线较陡,说明提取压力与保压时间交互作用显著,而保压时间与乙醇浓度交互作用的响应面图和等高线图曲线相对平缓,对绿原酸得率影响的显著性次之,且图中的等高线均为椭圆形,表明其交互作用显著,这与回归方程的各项方差分析结果一致[11-13]。

图7 各因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface map and contour map of interaction of various factors

2.3 最佳配方与模型验证

根据三维响应图可以看出,利用Design-Expert软件对配方进行优化,得到金银花绿原酸的最佳提取条件为:提取压力324.018 MPa,保压时间10.573 min,提取时间2.082 h,料液比10.440 mg/L,乙醇浓度61.822%,得率预测值为5.090%。校正后最佳条件为:提取压力325 MPa,保压时间10 min,提取时间2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇浓度60%。根据此条件,验证回归模型的有效性,3次验证实验表明,实测得率平均值为4.872%±0.049%,与预测理论值仅相差0.43%,说明该模型的拟合程度较好,此回归方程能较好的预测综合评分,具有一定的指导意义。

3 结论

各因素对金银花绿原酸得率影响的次序为:提取压力>保压时间>乙醇浓度>提取时间>料液比。金银花绿原酸提取的最佳条件为:压力325 MPa,保压时间10 min,提取时间2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇浓度60%。在此条件下,绿原酸得率为4.872%±0.049%。实验证明,超高压处理能够提高绿原酸的得率。