虾夷扇贝内脏源金属硫蛋白的提取工艺优化

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(1.浙江省海洋水产研究所,浙江舟山 316021;2.浙江省海水增养殖重点实验室,浙江舟山 316021;3.浙江海洋大学,浙江舟山 316021；4.中国水产科学研究院,北京 100141)

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类广泛存在于生物中的低分子质量(6～7 kDa)、高金属含量、无芳香族氨基酸、富含半胱氨酸(20%～30%)的功能独特的金属结合蛋白[1]。金属硫蛋白中大量巯基赋予了其螯合重金属离子功能,从而具备重金属解毒作用[2],MT清除自由基的能力明显强于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽,还可调节生物体内微量元素浓度,对细胞代谢的调节,细胞分化和增殖的控制以及在参与紫外(UV)诱导反应中都有重要作用,在食品、医药、保健、环境、化妆品、生物工程等领域中具有重要应用价值[3-4]。较多文献报道了从兔肝、真菌、细菌及海藻中提取金属硫蛋白[5-7],贝类中的研究较少。目前只能购买到国内市场上的兔肝源金属硫蛋白,但其制备成本高,2018年市场价约为20万元/克。虾夷扇贝,滤食性双壳贝类,是我国重要的养殖贝类之一。体内尤其是内脏团中易于富集重金属[8]。工业中虾夷扇贝的加工原材料多选用其闭壳肌,制成干制品或真空包装食品,内脏作为下脚料,利用率低。金属硫蛋白主要富集在金属元素含量丰富的肝脏、肾脏等内脏器官中,因此虾夷扇贝内脏可以作为提取金属硫蛋白的良好原材料,同时获得其纯品并研究应用功能特性,推进金属硫蛋白的广泛使用意义重大。

本研究从虾夷扇贝内脏中提取金属硫蛋白,采用单因素和响应面法优化其提取条件,并对得到的粗提物进一步研究,致力于得到一种高效快速的提取方法及低成本金属硫蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虾夷扇贝 购买自大连刘清水产品旗舰店;分子筛预装柱(Enrich SEC 70)(BIO-RAD);三羟甲基氨基甲烷(Tris) 生物试剂,北京索莱宝科技有限公司;5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司;MT-I对照品、MT-II对照品 大连联合博泰生物技术有限公司;乙二胺四乙酸二钠、盐酸、柠檬酸、磷酸氢二钠 均为优级纯,国药集团。

T18匀浆机 ULTRA-TURRAX;JXN-30高速冷冻离心机 贝克曼库尔特(Beckman Coulter Avanti);UV-3100BPC紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;微波消解仪 迈尔斯通(Milestone ETHOS A);7900电感耦合等离子体质谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;全自动蛋白纯化仪 美国伯乐(BIO-RAD)。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理方法 鲜活虾夷扇贝用过滤海水(过0.22 μm除去杂质)冲洗后,去壳,取其内脏团匀浆(转速10000 r/min,每次3 min,重复三次),备用。

1.2.2 虾夷扇贝内脏中金属元素含量测定 取匀浆组织适量,按照现行国标方法[9],采用微波消解-电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS),测定虾夷扇贝中Zn、Pb、Cd、Cu、As几种元素含量。

1.2.3 虾夷扇贝内脏中金属硫蛋白提取 参阅相关文献的提取方法并稍加修改[9-11]。取1.2.1中的匀浆组织适量,加入3倍体积(质量/体积)Tris-HCl提取剂(提取剂需提前配制,放置4 ℃预冷),同时加入1%三(2-羧乙基)膦(Tris-2-carboxyethyl-fosphine,TCEP)作为还原剂,加入Tris-HCl提取溶液后4 ℃提取约15 h,然后10000 r/min离心20 min,收集上清液加热至一定温度,除掉热不稳定的大分子蛋白组分,冰水浴快速冷却后4 ℃10000r/min离心20 min,收集上清液,加入3倍体积-20 ℃乙醇,4 ℃沉淀约15 h,最后4 ℃条件下将沉淀物分离,弃去上清液后加入10 mL Tris-HCl缓冲液,室温下溶解3～4 h,溶液4 ℃再次10000 r/min离心20 min,收集上清液真空冷冻干燥后得到MT粗提物。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 Tris-HCl浓度对提取液中MT含量的影响 设定Tris-HCl的pH为8.0,加热温度为75 ℃,考察Tris-HCl浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L时对提取液中MT含量的影响。

1.2.4.2 Tris-HCl pH对提取液中MT含量的影响 设定Tris-HCl的浓度为0.01 mol/L,加热温度为75 ℃,考察Tris-HCl提取剂pH为5、6、7、8、9时对提取液中MT含量的影响。

1.2.4.3 加热温度对提取液中MT含量的影响 设定Tris-HCl的浓度为0.01 mol/L,pH为8.0,考察加热温度为40、50、60、70、80 ℃时对提取液中MT含量的影响。

1.2.5 响应面试验 在单因素实验的基础上,利用响应面法优化MT的提取工艺,选取Tris-HCl的浓度、Tris-HCl pH和加热温度为考察因素,利用Box-Behnken模块设计三因素三水平试验,对提取条件进行优化,响应面设计实验因素及水平见表1。

表1 响应面设计实验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 MT含量测定 选择操作简便,快速直观的DTNB法测定样品中MT含量。参阅文献[12-14]中的方法并稍加改变。配制兔肝MT-I及MT-II混合对照品,浓度均为1 μg/μL。在试管中分别加入20、40、60、80、100、150 μL的MT标准溶液,加入10 μL 1.2 mol/L盐酸溶液和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置于暗处反应10 min脱去金属,之后加入5 mmol/L DTNB试剂混匀3 min,使MT与DTNB形成黄色络合物,用0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.25)稀释至4 mL,在412 nm波长处测定显色产物硫代硝基苯甲酸阴离子(TNBA)的量。样品测定为加入1 mL样品溶液,其他试剂同上。以兔肝MT-I及MT-II混合对照品浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程y=0.0172x-0.0061(R2=0.998),以此计算虾夷扇贝内脏源MT粗提物的浓度。

1.2.7 MT分离纯化方法 选用亲水性聚甲基丙烯酸酯填料的分子筛预装柱(Enrich SEC 70),将兔肝-金属硫蛋白对照品MT-I和MT-II用超纯水溶解,配制成浓度为1 mg/mL,然后稀释到0.25 mg/mL,7000 r/min 离心5 min,过0.22 μm滤膜,取1 mL样品注入样品环中,利用全自动蛋白纯化仪进行分子筛柱层析。流动相0.01 mol/L的Tris-HCl(pH8.25),流速0.5 mL/min。同时监测220、250、275 nm波长下流出液的信号值。流动相平衡2个柱体积后上样,仪器连接自动收集器,每管收集3 mL。称取适量虾夷扇贝内脏源MT粗提物复溶,7000 r/min离心5 min,过0.22 μm滤膜后上机,其他条件同上。以保留时间定性,峰面积占比计算纯度。

淖尔水质超标物主要有pH值、全盐量、氯化物和硬度，盐分处于主导地位。根据农田灌溉水质要求和滴灌工程设计要求，降低盐分和抗堵塞是淖尔水质处理的关键。考虑灌溉的低成本和实效性要求，水源处以分凌水或引黄灌溉水与淖尔蓄水量按一定比例混合稀释，以降低淖尔盐分含量。首部采用泵前低压网式过滤器+叠片过滤器组合模式，田间采用抗堵型内镶贴片式灌水器可实现低成本高效过滤。

1.3 数据处理

所有实验样品做3个平行,运用Excel 2010版对单因素试验数据进行处理,运用Design Expert 8.0.1软件对Box-Behnken实验进行设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 虾夷扇贝内脏中金属元素含量测定

根据ICP-MS测定的上机浓度及称样质量,计算出各金属元素含量,具体数值见表2。由表2可知,在虾夷扇贝内脏中,Zn>Cd>Cu>As>Pb。这一结果与文献报道结果一致[15-16]。Zn、Cu是生物体生长所需的微量元素,但含量过高也会对生物体产生危害。Cd不是虾夷扇贝生长所需元素,但含量居第二高,说明虾夷扇贝对Cd具有一定的富集作用。

表2 虾夷扇贝内脏中元素含量Table 2 The content of elements in Patinopecten yessoensis viscera

2.2 单因素试验

2.2.1 提取剂浓度对MT含量的影响 Tris-HCl缓冲液性质稳定,与生理体液的相容性好,且其与钙、镁离子不会形成沉淀,而且相同pH、相同浓度的Tris-HCl缓冲液的离子强度比其他盐类缓冲液的离子强度低,这对蛋白类测定尤为重要,因为高离子强度容易使某些蛋白质降低活性甚至完全失去活性[17],所以选择Tris-HCl作为提取剂。同时Tris-HCl缓冲液浓度与提取液中MT含量密切相关。由图1可知,Tris-HCl浓度由0升至0.01 mol/L时,MT含量有增大的趋势,但不明显,Tris-HCl浓度由0.01升至0.03 mol/L时,MT含量缓慢下降,为更精确确定Tris-HCl浓度,响应面优化范围设置为0.01～0.03 mol/L。

图1 Tris-HCl浓度对MT含量影响Fig.1 The effect of concentration of extract on MT content

2.2.2 提取剂pH对MT含量的影响 Tris-HCl缓冲液pH受温度影响大,一旦温度改变,pH将发生变化,从而导致蛋白质活性改变,所以提取过程中尽量保持同一温度。同时考察pH对其含量的影响。由图2可知,提取剂pH由5升至7时,MT含量逐渐增大,但pH在7～9时,MT含量变化不明显。根据文献报道,水生生物金属硫蛋白的等电点在3.5～6.0之间[11],为防止提取时金属硫蛋白产生沉淀,Tris-HCl溶液的pH比等电点高一个单位左右,进一步参照相关文献[7],MT提取剂多为碱性,为进一步精确确定pH范围,综合以上因素将响应面优化范围设置为7.40～9.10。

图2 Tris-HCl pH对MT含量影响Fig.2 The effect of pH on the content of MT

2.2.3 加热温度对MT含量的影响 MT本身具有一定的耐热性,可利用这一特性除去多数热不稳定蛋白质,进一步提高MT含量。由图3可知,随着温度升高,MT含量呈现先升高后下降的趋势,加热温度在60 ℃时MT含量最高。结合单因素结果及考虑MT的热稳定性,同时为除去一些不耐热的杂蛋白,因此,响应面实验优化范围设置为60～80 ℃。

图3 加热温度对MT含量的影响Fig.3 The effect of heating temperature on the content of MT

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面模型与分析 根据单因素实验结果设计响应面试验因素水平,响应面实验设计方案及结果如表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design and results

表4 二次响应面回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由方差分析可知,该模型的F=9.03,p=0.0042<0.01,表明实验采用的二次模型是极显著的[18],在统计学上是有意义的。模型的失拟项的F=4.64,p=0.0860>0.05,不显著,说明该模型具有很好的拟合度。因素A Tris-HCl缓冲液浓度的p=0.0008<0.01,说明提取剂浓度对提取液中MT含量的影响是极显著的(p<0.01),对于A2、B2其p值均小于0.01,说明C2的p值小于0.05,说明C2对提取液中MT含量的影响是显著的(p<0.05),而B、C一次项及3个因素的二次交互项的影响均不显著(p>0.05),结合F值可知,A、B及C三因素对MT含量的影响依次为:A(提取剂浓度)>C(加热温度)>B(提取剂pH)。

2.4.2 响应面优化 响应面是各因素对响应值影响结果构成的三维空间曲面图,可直接反映各因素与响应值的交互作用。曲面越陡峭,对响应值的影响越大,而等高线形状可反映因素交互作用的显著程度[19-20]。响应曲面及等高线图如图4所示。从图4可以看出响应面都为开口向下的凸形曲面,说明实验存在提取液中MT含量的最大值。由图4b等高线图可知,A和B两因素的等高线成椭圆形,沿A轴提取剂浓度的等高线较为密集,B轴提取剂pH的等高线较为稀疏,说明提取剂浓度对MT含量的影响比提取剂pH的影响大,3D曲面图也可看出提取剂浓度的影响大于提取剂pH;图4d中,B与C的等高线成圆形,说明B、C两因素交互作用对MT含量的影响不显著;由图4f等高线图可知,A和C两因素的等高线成椭圆形,沿A轴提取剂浓度的等高线较为密集,沿C轴加热温度的等高线较为稀疏,说明提取剂浓度对MT含量的影响比加热温度的影响大,由3D图可知提取剂浓度对MT含量的影响要高于加热温度。因此,结合等高线、3D图及F值可知,三因素对MT含量的影响依次为:提取剂浓度>加热温度>提取剂pH。提取剂浓度与提取剂pH的响应面图和提取剂浓度和加热温度的响应面图都比较陡峭,说明它们的交互作用比较明显,这与表4的回归分析结果一致。

图4 各因素交互作用对MT含量影响3D图及等高线图Fig.4 Response surface showing the effect of different factors on the total MT and contour

2.4.3 最优条件的优化与验证 根据Design-expert 8.0.1软件处理实验数据所得结果,虾夷扇贝内脏中金属硫蛋白的最佳提取条件为,Tris-HCl提取剂浓度为0.01 mol/L,提取剂pH为8.23,加热温度为69.79 ℃,在此条件下,最佳响应结果为0.127 mg/g。实际实验选择为Tris-HCl提取剂浓度为0.01 mol/L,提取剂pH为8.23,加热温度为70 ℃,实际测得的MT含量为0.115 mg/g。因此响应面法得到的预期优化条件不仅准确可靠,而且具有实际价值。

2.5 MT分离纯化

将兔肝-金属硫蛋白混合对照品和虾夷扇贝内脏源粗提物经分子筛柱层析后,同时监测3个波长下流出液的信号值,MT-I和MT-II混合对照品流出液及虾夷扇贝内脏源粗提物均在λ=220 nm时响应值最大。对照品谱图如图5,按保留时间先后顺序分别命名为MF1、MF2,虾夷扇贝内脏源粗提物谱图如图6所示,按保留时间先后顺序分别命名为Py1、Py2。由图5、图6可知,虾夷扇贝内脏源粗提物中组分的保留时间与兔肝-金属硫蛋白混合对照品的保留时间接近,且都在λ=220 nm响应值最高,据此可推测粗提液中组分即为虾夷扇贝内脏源金属硫蛋白2种异构体的混合物。MT与金属结合而产生的特征吸收峰为:Zn-MT 220 nm,Cd-MT 250 nm,Cu-MT 275 nm,据吸收峰对MT进行分离鉴定[21-22]。而结合ICP-MS多元素测定结果,原材料中Zn含量明显高于Cd、Cu的含量,兔肝源对照品结合的也是Zn,综合以上因素可以推测提取到的MT类型为Zn-MT。由于MT-I和MT-II对照品分子量接近,所以在分子筛柱层析中较难分开。同理推测样品中为金属硫蛋白的2种异构体。对图谱中各个峰积分后,按峰面积占比算得虾夷扇贝内脏源粗提液中金属硫蛋白的纯度平均为81%。

图5 兔肝金属硫蛋白混合对照品图谱Fig.5 Chromatogram of 2 kinds of MTs in standard solution

图6 样品图谱Fig.6 Chromatogram of sample

3 讨论与结论

通过单因素及响应面法优化提取条件,获得了各因素的最佳值:Tris-HCl提取剂浓度为0.01 mol/L,提取剂pH为8.23,加热温度为70 ℃。在此条件下,实际实验结果为0.115 mg/g,与模型预测的理论值基本相符。因此,本研究得到了从虾夷扇贝内脏中提取金属硫蛋白的有效方法。一步纯化后,获得2种异构体的金属硫蛋白混合物,其纯度约为81%。

目前关于金属硫蛋白的研究已有多篇报道。Rubens T H等[23]经过一步亲和色谱柱层析技术从亚马逊大盖巨脂鱼和酿酒酵母中获得了纯度较高的金属硫蛋白。Sandra S R等[24]通过HPLC-ICP-OES将贻贝中类金属硫蛋白分离开,色谱柱类型为阴离子交换,流动相选用75 mmol/L Tris-HCl(pH7.4),流速0.8 mL/min。两种类金属硫蛋白在10 min内可分离开。Carolina L T-D等[14]从罗非鱼的胆汁和肝脏中提取到了MT,采用响应面法优化了加热温度、2次离心时间及在提取剂中加入不同的还原剂等因素对MT得率的影响,采用分光光度法测定MT浓度,SDS-PAGE测定相对分子质量。上述研究成果均获得了纯度较高的金属硫蛋白,本文研究结果与上述研究结果类似,获得了2种类型MT的混合物。后续还需进一步将2种类型MT分离,获得纯品后还需进行结构鉴定。虽然关于金属硫蛋白的研究成果已较多,但关于其结构鉴定方法却鲜有报道。只有掌握蛋白结构才能全面了解其性质,从而为其充分广泛的应用提供全面的理论知识。所以,对金属硫蛋白结构的鉴定意义重大,今后也将在此领域进行深入研究。