两种火龙果果皮红色素提取工艺优化及其抗氧化活性

, , ,杨玉,,

(1.肇庆学院生命科学学院,广东肇庆 526061;2.肇庆学院食品与制药工程学院,广东肇庆 526061)

目前,食品、饮料、酒类、糕点、药业、化妆品等行业广泛应用着色剂,这种着色剂俗称色素。色素是一种重要的食品添加剂,在食品生产过程中,生产者为了改善食品的色、香、味等感官品质,往往使用人工合成色素来增强食品的着色效果。在食品着色剂中,红色素是一类非常重要的食品色素。红色色调能刺激人的大脑,给人以兴奋感,有增加食欲和增强购买欲的作用,因此红色素被广泛应用于食品中。目前,我国常用的食品级人工合成红色素主要有苋菜红、胭脂红等,但大都有其限量标准。研究表明,某些人工合成红色素超量使用会对人体健康造成慢性中毒、致病致癌等危害,相比而言,天然红色素大部分来源于植物色素,绝大多数无副作用,安全性高,因此消费者更青睐于添加天然红色素的食品[1]。从植物中提取安全无毒并具有特殊生物活性的天然食用红色素,已成为现时着色剂研究的热点。

甜菜红素(Betalains)是一种吲哚来源的天然植物红色素,主要存在于石竹目仙人掌科、藜科及苋科等植物红色组织中,在植物抗逆生理保护机制中发挥重要的作用。甜菜红素是一种安全无毒害、兼有一定营养保健功效的天然色素,具有抗氧化、预防肿瘤、降低血脂、减缓肌肉疲劳等作用[2]。在1976年,联合国FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会便制定了甜菜红素的使用标准。目前,市场上出售的甜菜红素大都以食用红甜菜为原料加工而成。甜菜红素的提取方法很多,由于甜菜红素溶于水,水浸提法是最常用的提取方法,此外如超声波辅助萃取技术[3]、超临界萃取技术[4]以及膜处理技术[5]等辅助方法也见诸于文献报道。

火龙果(HylocereusundutusL.)又称红龙果、仙蜜果,是仙人掌科三角属多年生多浆植物果实,最先在巴西、墨西哥等热带地区种植,目前在我国的海南、广东、广西、福建等省份均有种植[6]。近年,随着广东省肇庆市农业产业转型升级,肇庆市鼎湖区莲花、高要区白诸、莲塘、白土等镇均大规模种植白肉红皮、白肉黄皮和红肉红皮等品系火龙果。白肉红皮火龙果果皮和红肉红皮火龙果果肉及果皮都含有大量的红色素,为甜菜苷类水溶性天然色素[7-9]。火龙果果皮虽然富含红色素,但在食用或加工过程中常常作为废弃物,不仅加重了环境治理的负担,还造成了可利用植物色素资源的浪费。因此,对火龙果果皮红色素提取工艺及其生物活性的研究,可明显提升火龙果加工的附加值。目前,有学者分别对火龙果果肉或果皮中红色素的提取工艺做了初步探究,但对该天然红色素的科学分类属于“花色苷”或“ 甜菜色素”还存在疑义[10-12]。

本文在鉴定火龙果果皮红色素种类的基础上,采用超声波辅助乙醇浸提法,运用单因素实验和正交试验优化色素提取工艺,综合比较两个品种火龙果果皮红色素的抗氧化活性,旨在为肇庆地区火龙果品种选育及果皮的合理深化利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜红肉红皮和白肉红皮火龙果 广东省肇庆市农业局提供,洗净,晾干,去掉果肉及绿色果皮部分,剪成条状物,50 ℃烘干,粉碎,过40目筛,果皮粉末分别标记为红肉红皮(RP)和白肉红皮(WP),密封备用;甜菜红素标准品 上海康朗生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·) 上海品纯试剂有限公司;甲醇 成都市科龙化工试剂厂;无水乙醇 天津市北联精细化学品开发有限公司;铁氰化钾、亚硝酸钠 天津市广成化学试剂有限公司;水杨酸 天津市福晨化学试剂厂;对氨基苯磺酸、硫酸亚铁、双氧水 广州化学试剂厂;三氯乙酸 天津市大茂化学试剂厂;盐酸萘乙二胺、三氯化铁 天津市科密欧化学试剂有限公司;以上试剂 均为分析纯。

KJ-B型600 W超声波清洗机 广州番禺科进超声波设备厂;40B型台式离心机 上海安亭仪器有限公司;UV759紫外-可见分光光度计、JA2003型电子天平 上海精科仪器有限公司;UPLC-XEVO TQD超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪 爱尔兰Waters公司;AB-8大孔树脂吸附柱、SD-B冻干机、RE-52型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司;DHG-9240A型电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;Q-300B旗箭中药五谷干磨粉碎机 上海冰都电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 火龙果果皮红色素粗提物的制备 准确称取两个品种的火龙果果皮粉末各10 g,分别加入50%乙醇(v/v,下同)溶液50 mL,置于50 ℃超声波频率28 kHz的超声波清洗仪中浸提30 min,减压抽滤,真空浓缩30 min,50 ℃电热鼓风干燥24 h,密封放置4 ℃冰箱备用。

1.2.2 火龙果果皮红色素粗提物的分析鉴定 紫外可见光谱法:分别取等量的色素抽滤液,用去离子水稀释10倍后,在450～700 nm范围内进行光谱扫描。

高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)[13]:分别称取火龙果果皮色素粗提物各10 mg,加入1 mL去离子水,涡旋30 s,用微孔滤膜(0.22 μm)滤过,取滤液进样,进样量为10 μL。HPLC-MS/MS检测条件:流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(60/40,v/v),流速为0.3 mL/min;色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEN C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);质谱条件:离子源:ESI源,正离子扫描,多反应监测;毛细管电压:2.50 kV;离子源温度:150 ℃。在确定母离子的基础上,采用子离子扫描方式对其进行二级质谱分析,对子离子进行优化选择,确定定量离子和定性离子(表1)。

表1 ESI+模式下甜菜红素参数设定Table 1 MS/MS acquisition parameters for betalain at ESI+ mode

1.2.3 甜菜红素得率的测定

1.2.3.1 甜菜红素含量的测定 参考袁亚芳等[14]的方法,采用摩尔消光系数法计算提取液中甜菜红素的含量。

C(g)=(OD538×550.11)/61600

式(1)

式(1)中,C为甜菜红素含量,OD538为吸光值,550.11为标准甜菜红素摩尔分子质量,61600为标准甜菜红素摩尔消光系数。

1.2.3.2 甜菜红素得率计算

得率(%)=[(C×V)÷m]×100

式(2)

式(2)中,C为提取液中甜菜红素含量(g),V为提取液体积(mL),m为果皮粉末质量(g)。

1.2.4 火龙果果皮甜菜红素提取的单因素实验 定量称取两个品种火龙果果皮粉末若干份,经过预实验,分别在不同乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度等条件下进行单因素实验,以甜菜色素得率为指标,得出单因素实验的最佳条件。

1.2.4.1 乙醇浓度对甜菜红素得率的影响 称取0.50 g火龙果果皮粉末,按料液比1∶50 (g/mL)的比例,分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液,于40 ℃超声波清洗仪中恒温提取25 min,减压抽滤,取上滤液在538 nm波长下测定甜菜红素含量。

1.2.4.2 料液比对甜菜红素得率的影响 分别称取0.50 g果皮粉末,RP按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)的比例,WP按照料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 (g/mL)的比例加入40%乙醇溶液,于40 ℃超声波清洗仪中提取25 min。用40%乙醇溶液定容到50 mL,减压抽滤,取上滤液在538 nm波长下测定甜菜红素含量。

1.2.4.3 超声时间对甜菜红素得率的影响 称取0.50 g两个品种火龙果果皮粉末,RP按料液比1∶20 (g/mL)、WP按料液比1∶50 (g/mL)的比例加入40%乙醇溶液,于40 ℃超声波清洗仪中,RP分别提取5、10、15、20、25 min,WP分别提取15、25、35、45、55 min,减压抽滤,取上滤液在538 nm波长下测定甜菜红素含量。

1.2.4.4 超声温度对甜菜红素得率的影响 称取0.50 g的两种火龙果果皮干燥粉,RP按料液比1∶20 (g/mL),WP按料液比1∶50 (g/mL)的比例加入40%乙醇溶液,于30、40、50、60、70 ℃温度下超声波清洗仪中,RP提取10 min,WP提取35 min,减压抽滤,取上滤液在538 nm波长下测定甜菜红素含量。

1.2.5 火龙果果皮甜菜红素提取工艺正交试验 根据单因素实验结果,选择乙醇浓度、料液比、超声时间和超声温度4个因素进行正交试验,进一步研究提取火龙果果皮色素的最佳提取工艺,两种品种火龙果果皮色素提取各因素水平如表2所示,选用L9(34)正交试验表进行试验设计。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 甜菜红素粗提物的纯化 确定最佳提取条件后,按照如下流程提取纯化果皮甜菜红素。称取两种火龙果果皮粉末10 g,分别以最佳提取条件提取甜菜红素抽滤液。抽滤液上样AB-8大孔树脂吸附柱充分吸附,去离子水洗涤去杂质,用30%乙醇解吸附,洗脱液即为火龙果果皮甜菜红素提纯液。提纯液减压浓缩(压力为0.08 MPa,温度为40 ℃)处理后,冻干机进行冷冻干燥(真空度0.09 MPa,温度为-40 ℃),得到火龙果果皮甜菜红素的提纯物,称重计算产量,避光保存备用[15]。

1.2.7 两种火龙果果皮甜菜红素抗氧化活性的测定 将上述火龙果果皮提纯物用去离子水配制为各浓度溶液,综合检测果皮甜菜红素的抗氧化活性。

式(3)

1.2.7.2 对羟自由基(·OH)清除率的测定 取不同质量浓度(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)的两种品种果皮色素液各1 mL于具塞试管中,分别加入6 mmol/L硫酸亚铁溶液、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、6 mmol/L 过氧化氢各2 mL,37 ℃恒温水浴35 min,于波长为510 nm处测定吸光值,记为Ax,以2 mL双蒸水作为空白组,测得吸光值记为A0,没有加入过氧化氢溶液测定的吸光值记为Ax0[18]。通过式(4)计算·OH清除率。

式(4)

式(5)

1.2.7.4 总还原力的测定 取不同质量浓度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的果皮色素液各2.5 mL,加入pH6.6磷酸缓冲液(0.2 mol/L)2.5 mL和10 g/L铁氰化钾1.5 mL,50 ℃水浴20 min,加入100 g/L三氯乙酸1.5 mL,于3000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加2.5 mL蒸馏水和1 g/L三氯化铁0.5 mL,10 min后于波长700 nm处测定其吸光度[20]。

1.3 数据处理

以上实验均平行测定3次,实验结果以均值±标准偏差表示。采用数据处理软件SPSS 19.0及Design Expert 8.05对所得实验数据进行分析,采用Origin Pro 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 火龙果果皮红色素物质的鉴定

由图1可见,两种火龙果果皮红色素的吸收光谱最大吸收峰都在538 nm处,与甜菜红素标准物的吸收峰值一致。同时,经HPLC-MS/MS检测结果表明(图2),红肉红皮和白肉红皮火龙果的果皮红色素为甜菜红素。可见,经紫外光谱和液质联用法鉴定,两种火龙果果皮色素均为甜菜红素,并且在相同的实验条件下,粗提物RP中甜菜红素的OD值均高于WP,表明RP中甜菜红素相对含量高于WP。

图1 火龙果果皮红色素的吸收光谱及相对含量Fig.1 Absorption spectra and relative content of betalains in the pitaya peel

图2 火龙果果皮甜菜红素的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of betalains from the pitaya peel

2.2 两个品种火龙果果皮甜菜红素提取工艺的优化

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 乙醇浓度对火龙果果皮甜菜红素得率的影响 由图3可知,当乙醇浓度为30%～40%,两种果皮甜菜红素的得率均随乙醇浓度的增加而逐渐提高,乙醇浓度达40%时,甜菜红素得率均达到最大值,而后随着乙醇浓度的增加,甜菜红素的得率反而下降。这可能是由于火龙果皮甜菜红素是水溶性色素,高浓度的有机溶剂反而对甜菜红的溶解起抑制作用。据此选择30%、40%、50%的乙醇浓度,作为正交试验的3个水平。

图3 乙醇浓度对火龙果果皮甜菜红素提取的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of betalains from pitaya peel注:a:WP;b:RP。图4～图6同。

2.2.1.2 料液比对火龙果果皮甜菜红素得率的影响 由图4可知,料液比在1∶30～1∶50 (g/mL)范围内,WP甜菜红素的得率增大,料液比在1∶50～1∶70 (g/mL)范围内,WP甜菜红素得率下降;料液比在1∶10～1∶20 (g/mL)范围内,RP甜菜红素得率增大,料液比在1∶20～1∶50 (g/mL)范围内,RP甜菜红素得率下降。WP和RP甜菜红素的得率最高的料液比分别是1∶50和1∶20 (g/mL)。可见料液比也是影响火龙果果皮甜菜红素得率的重要因素之一。经综合分析,WP料液比为1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL),RP料液比为1∶10、1∶20、1∶30 (g/mL)作为正交试验的3个水平。

图4 料液比对火龙果果皮甜菜红素提取的影响Fig.4 Effect of material to liquid ratio on the extraction of betalains from pitaya peel

2.2.1.3 超声时间对火龙果果皮甜菜红素得率的影响 由图5可知,WP甜菜红素得率在15～35 min时呈上升趋势,在35 min时达到最大值,超声时间大于35 min时,得率反而有小幅下降。而当超声时间为5～10 min时,RP甜菜红素得率上升,但超声时间大于10 min时,其甜菜红素得率呈下降趋势。故选择WP超声时间为25、35、45 min,RP超声时间5、10、15 min,作为正交试验的3个水平。

图5 超声时间对火龙果果皮甜菜红素提取的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction of betalains from pitaya peel

2.2.1.4 超声温度对火龙果果皮甜菜红素得率的影响 由图6可知,当超声温度在30～40 ℃范围内时,两个品种果皮甜菜红素的得率均升高;当超声温度达到50 ℃时,WP甜菜红素溶出最充分,而RP甜菜红素提取效果最优的超声温度是40 ℃,超过50 ℃后,两种火龙果果皮甜菜红素的得率反而有所下降。故选择超声温度为40、50、60 ℃;RP超声温度为30、40、50 ℃作为正交试验的3个水平。

图6 超声温度对火龙果果皮甜菜红素提取的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of betalains from pitaya peel

2.2.2 正交试验结果 在乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间的4个因素的正交试验中(表3～表4),由极差R值分析可知,影响WP甜菜红素得率最大的因素为乙醇浓度,其次为提取温度,再次为料液比,最后为提取时间。影响RP甜菜红素得率最大的因素为料液比,其次为提取温度,再次为乙醇浓度,最后为提取时间。WP甜菜红素最佳提取组合为A2B1C1D1,即:乙醇浓度为40%,料液比为1∶40,超声时间为25 min,超声温度为40 ℃;RP甜菜红素最佳提取组合为A2B3C3D1,即:乙醇浓度为40%,料液比为1∶30,超声时间为15 min,超声温度为30 ℃。以相同实验方法,实施3次平行实验,进一步验证最佳工艺条件的可靠性,结果显示WP和RP甜菜红素得率分别为(0.856%±0.015%)和(0.915%±0.013%),理论值与实际值基本吻合,表明WP和RP甜菜红素最佳提取组合分别为A2B1C1D1和A2B3C3D1。

表3 WP甜菜红素提取工艺的正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment of the extraction technology of WP betalains

表4 RP甜菜红素提取工艺的正交试验结果Table 4 The results of orthogonal experiment of the extraction technology of RP betalains

2.3 火龙果果皮甜菜红素含量的纯化

经纯化工艺流程获得的果皮甜菜红素提纯物,WP甜菜红素产量为1.25 g,得率为12.5%(即12.5 g/100 g干品);RP甜菜红素产量为1.54 g,得率为15.4%(即15.4 g/100 g干品),表明两种火龙果果皮甜菜红素含量丰富,RP甜菜红素产量是WP的1.232倍。

2.4 两个品种火龙果果皮甜菜红素抗氧化活性的比较

2.4.1 火龙果果皮甜菜红素对DPPH·的清除能力 DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基,溶液在波长517 nm处有特征吸收峰,呈紫红色[21]。自由基清除剂可与其单电子配对而使其吸收减弱,减弱程度与其所接受的电子数成定量关系,因此,可用分光光度法评价火龙果皮色素提取液对自由基的清除情况。图7显示,在一定样品浓度范围内,两个品种火龙果果皮甜菜红素对DPPH·有明显的清除效果。当样品浓度达2.5 mg/mL时,WP和RP甜菜红素对DPPH·的清除率分别为85.00%和95.60%,对DPPH·的清除中,WP和RP甜菜红素样品浓度(x)与清除率(y)间的回归方程分别为y=30.493x+15.059,R2=0.9701和y=33.286x+18.354,R2=0.9645。可见,WP和RP甜菜红素对DPPH·的IC50分别为1.15、0.95 mg/mL,表明两种果皮甜菜红素对DPPH·有明显的清除效果,且RP甜菜红素的清除效果优于WP,但低于等浓度的维生素C的清除能力。

图7 两种火龙果果皮甜菜红素对DPPH·的清除能力Fig.7 DPPH· scavenging rates of betalains from two species of pitaya peel

2.4.2 火龙果果皮甜菜红素对·OH的清除能力 ·OH的清除结果可通过Fenton反应产生自由基,其510 nm最大吸收峰消失,建立以OD510变化反映羟自由氧化作用的比色测定法,可评价火龙果果皮色素溶液对·OH 的清除能力[22]。图8结果表明,在一定样品浓度范围内,两种品种火龙果果皮甜菜红素对·OH有明显的清除效果。当样品浓度为10 mg/mL时,WP和RP甜菜红素对·OH的清除率分别为78.30%和94.90%。对羟自由基(·OH)清除中,WP和RP甜菜红素样品浓度(x)与清除率(y)间的回归方程分别为y=7.2422x+6.9153,R2=0.9988和y=8.1208x+12.926,R2=0.9913,WP和RP甜菜红素对·OH的IC50分别为5.95、4.57 mg/mL,表明在较低的样品浓度下,两种果皮甜菜红素对·OH有明显的清除效果,且RP甜菜红素的清除效果优于WP甜菜红素。

图8 两种火龙果果皮甜菜红素对·OH的清除能力Fig.8 ·OH scavenging rates of betalains from two species of pitaya peel

图9 两种火龙果果皮甜菜红素对亚硝酸根的清除能力Fig.9 Removal rate of nitrite of betalains from two species of pitaya peel

2.4.4 火龙果果皮甜菜红素的总还原能力比较 图10结果所示,试验采用Oyaizu法,通过观察添加不同浓度火龙果果皮甜菜红素溶液后Fe3+和Fe2+之间的转移来检测样品的还原能力。火龙果果皮甜菜红素具有一定的总还原力,在试验的质量浓度范围,随着样品浓度的增加,吸光度增大,两者呈剂量依赖关系,吸光度越高,还原能力越强,且RP甜菜红素的总还原能力较优于WP甜菜红素,但两者略低于VC。WP和RP甜菜红素样品浓度(x)与清除率(y)间的回归方程分别为y=0.2267x+0.0738,R2=0.9878和y=0.2305x+0.1562,R2=0.9794,显示两种火龙果果皮色素溶液有较强的总还原能力。

图10 两种火龙果果皮甜菜红素的总还原力Fig.10 Total reducing power of betalains from two species of pitaya peel

3 结论

火龙果果皮富含甜菜红素,是获取安全无毒的天然红色素重要来源,可广泛应用于食品加工业、化妆品制造业等。经紫外可见光谱法和HPLC-MS/MS联用法双重验证,两种火龙果的果皮红色素均为甜菜红素。本文利用乙醇超声波辅助提取法提取火龙果果皮甜菜红素,通过单因素和正交试验优化其提取工艺,综合得出火龙果白肉红皮品种果皮甜菜红素的最佳提取工艺参数是:乙醇浓度40%,料液比1∶40 (g/mL),超声时间25 min,超声温度40 ℃;红肉红皮品种果皮甜菜红素最佳的提取工艺参数是:乙醇浓度40%,料液比1∶30 (g/mL),超声时间15 min,超声温度30 ℃。最优条件下WP和RP甜菜红素得率分别为(0.856%±0.015%)和(0.915%±0.013%)。与传统的溶剂浸取法相比[23-24],乙醇超声波辅助提取法可以很大程度上缩短生产周期,具有提高提取效率、节约溶剂等优点,而且果皮甜菜红素提纯物颜色艳丽,稳定性好。比较两者最佳的提取工艺参数可知,RP以其纯化工艺流程获得的提纯物产量是WP的1.232倍,色素得率更高。