四种小浆果浆汁活性成分及其抗氧化活性

2019-04-01,,,,,

食品工业科技 2019年5期

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(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

小浆果是一种多汁肉质单果,浆果类果树种类很多,多分布于我国北方地区,尤其是东北地区[1],除了具有独特的鲜食风味,还具有丰富的保健营养价值,具有抗氧化、抗癌、改善肝脏解毒等功效[2],是近些年来世界上发展最为迅速的“第三代”新兴水果,受到市场的青睐与欢迎。其中蓝莓(VacciniumSpp.)、树莓(RubuscorchorifoliusL. f.)、花楸(SorbuspohuashanensisH.)、蓝靛果忍冬(LoniceracaeruleaL.)、草莓(FragariaananassaDuch.)等小浆果富含水溶性色素如花青素,相比沙棘(HippophaerhamnoidesL.)、枸杞(LyciumbarbarumL.)的脂溶性色素更易被人体利用吸收,成为替代人工合成色素的潜力资源[3]。

我国蓝莓栽培起始于20世纪80年代,期间蓝莓产业发展突飞猛进,截止2017年底,我国蓝莓种植面积达70余万亩,预计未来3～5年内,蓝莓的种植面积将达300万亩,树莓在国外栽培历史悠久,但近年来中国的树莓产量也逐年提高,尤其是华北与东北地区[4-5]。蓝靛果和黑果腺肋花楸作为两种新兴的小浆果,由于较高的营养价值及保健功能,近年来也引起了人们的注意。树莓含有大量鞣花酸、单宁、槲皮素、没食子酸、花青素等,具有抗氧化、延缓衰老、消除疲劳和抗癌等作用[6-7]。蓝莓除了含常规的糖、酸、矿物质元素和维生素外,还富含花青素、蛋白质、超氧化物歧化酶(SOD)、熊果苷等成分,具有保护视力、延缓衰老、有效降低胆固醇、防止动脉粥样硬化、预防癌症等功效[8-9]。蓝靛果营养丰富,富含糖类、氨基酸、多酚、花青素等,具有抗病毒、抗癌、改善高血压、抵御疲劳、抗氧化等功效[10]。黑果腺肋花楸含有多种维生素和矿物质,还富含黄酮、花青素和多酚等物质,对心脑血管疾病具有特殊疗效,还具有抗炎、降血糖血脂、抗氧化等保健功能[11-12]。小浆果富含很多天然活性成分,有利于减少机体的损伤和疾病的发生,是活性氧清除的潜在来源,并逐渐成为小浆果研究的热点[8]。

国内小浆果大多以冻果形式出口海外市场,目前在小浆果的栽培和繁育技术上研究报道很多,针对小浆果的高值化研究还不足。本实验选取了两种目前市场上火热的小浆果蓝莓和树莓以及两种新兴小浆果蓝靛果和黑果腺肋花楸作为研究对象,通过酶法制备成浆汁,对其多酚、SOD、花色苷及总黄酮含量进行考察,以维生素C做阳性对照,采用不同的自由基清除体系及脂质过氧化探讨了其抗氧化活性,并对活性成分含量与抗氧化活性相关性分析,以期为功能性产品的开发提供理论依据,能使其广泛应用于功能食品、医疗保健及化妆品行业。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝靛果、树莓、蓝莓、黑果腺肋花楸浆果均购自东北长白山,鲜果成熟采摘后冷冻保存;果胶酶(酶活力为60000 U/mL)和β-葡萄糖苷酶(酶活力为4000 U/mL) 宁夏夏盛实业集团有限公司;芦丁国药集团化学制剂有限责任公司;Folin-Ciocalteu试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和邻苯三酚 Sigma公司;抗坏血酸、水杨酸、无水乙醇、甲醇、FeSO4、Tris碱、没食子酸、CH3COONa、EDTA·2Na等均为国产分析纯。

L5S紫外可见分光光度计上海仪电分析仪器有限公司;ESH105电子水分测定仪上海舜宇恒平科学仪器有限公司;L530离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;HWS24型电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司;THZ-82A水浴恒温振荡器苏州威尔实验用品有限公司;BXS07-WYA-2S数字阿贝折射仪北京北信科远仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理将冷冻保存的四种小浆果于常温下自然解冻30 min后,按照实验室之前优化的最佳酶解工艺,向鲜果中加入质量比1∶1的蒸馏水、质量分数为0.02%的果胶酶和0.1%β-葡萄糖苷酶,在38 ℃下不断搅拌复合酶解3 h完成后于4000 r/min离心20 min,得到上清即为小浆果浆汁样品。

1.2.2 固形物含量的测定根据NY/T 2637-2014[13]测定浆果中固形物含量来确定质量浓度。取2～3滴浆果浆汁均匀分布于棱镜表面,对准光源,记录折射仪读数。

1.2.3 多酚含量的测定采用GB/T 31740.2-2015[14]对茶多酚含量检测方法。分别取1 mL没食子酸标准液、水(空白对照)及四种浆果浆汁与5 mL的Folin-Ciocalteu试剂充分混匀,静置3～8 min后加入4 mL 7.5% Na2CO3水溶液混匀,60 min后,在765 nm下测定样液吸光值。以没食子酸作为标准品绘制标准曲线来定量小浆果中多酚,得到回归方程y=0.0132x+0.039,R2=0.9996,其中y代表吸光度,x代表没食子酸浓度(μg/mL),计算多酚含量。

式中,A为765 nm处的吸光值;SLOPEstd为没食子酸标准曲线的斜率;d为稀释因子。

1.2.5 花色苷含量的测定根据花色苷特有性质,参照pH示差法[16]稍作修改来测定样品中花色苷含量。四种小浆果浆汁分别用pH1.0的氯化钾缓冲溶液(0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67)和pH4.5的醋酸钠缓冲溶液(1 mol/L CH3COONa∶1 mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90)稀释10倍,对应空白组以溶剂代替样品,在510 nm和700 nm处测吸光值。以矢车菊-3-葡萄糖苷表示总花色苷含量,计算公式如下:

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式中,C为花色苷含量,mg/g;A510为510 nm处吸光值,A700为700 nm处吸光值;n为稀释倍数;449为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量;29600为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数。

1.2.6 总黄酮含量的测定参照GB/T 20574-2006,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定总黄酮含量[17]。以芦丁为标样,在碱性条件下于510 nm处测定显色液的吸光度确定样液中总黄酮的含量。分别吸取四种小浆果浆汁2 mL和30%乙醇溶液3 mL于试管中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL摇匀,放置6 min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL摇匀,6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,加水0.4 mL摇匀,于510 nm下测定吸光值,同时以2 mL样液和8 mL乙醇溶液作为对照溶液,空白组将样液替换成乙醇溶液。根据吸光值,利用芦丁标准曲线来计算样品中总黄酮的含量,得到回归方程y=1.2028x-0.0111,R2=0.9998,其中y代表吸光度,x代表芦丁浓度,mg/mL,计算总黄酮含量。

总黄酮含量(mg/mL)=Y×n

式中,Y为从回归方程求得的芦丁浓度,mg/mL;n为样液稀释倍数;V为样品体积,mL。

1.2.7 ·OH自由基的清除参考Li等[18]的方法来测定样品对羟自由基的清除效果。向试管中加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水杨酸-乙醇(9 mmol/L)和1 mL不同浓度的四种小浆果浆汁及VC溶液,随后加入1 mL H2O2(8 mmol/L)启动反应,涡旋混匀后于37 ℃水浴锅反应30 min,在510 nm下测定吸光值。对·OH自由基的清除作用公式如下:

式中,Ai为样品吸光值,Ai0为以蒸馏水代替H2O2测定的样品本底吸收值,A0为以蒸馏水代替样品溶液测定的空白对照吸光值。

式中,Ai为样品吸光值,Ai0为测定的样品本底吸收值,A0为以蒸馏水代替样品溶液测定的空白对照吸光值。

1.2.9 DPPH·自由基的清除根据Carmona-Jimenez等[21]和Marecek等[22]的方法测定样品对DPPH·自由基清除活性。向试管中加入2 mL DPPH溶液(2 mmol/L,甲醇配制)和2 mL不同浓度的四种小浆果浆汁及VC溶液,涡旋混匀,于室温黑暗条件下反应30 min,于517 nm下测定吸光值。对DPPH·自由基的清除作用公式如下:

式中,Ai为2 mL DPPH溶液+2 mL样品溶液的吸光值,Ai0为2 mL样品溶液+2 mL甲醇的本底吸光值,A0为2 mL DPPH溶液+2 mL甲醇的吸光值。

1.2.10 抗卵黄脂蛋白过氧化按照赵丽[23]的方法,采用Fe2+诱发脂质体的氧化来验证抗脂质过氧化功能。向试管中加入0.1 mL稀释至25倍的卵黄悬液(用pH7.45,0.1 mol/L 的PBS配制),加入不同浓度的四种小浆果浆汁及VC溶液,加入0.1 mL FeSO4·7H2O溶液(25 mmol/L),随后用PBS补足至2 mL。其对照组不加样品溶液,其他同上。在37 ℃下水浴振荡15 min。然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸,静置10 min,在3500 r/min下离心10 min,取2 mL上清液加入1 mL 0.8%的硫代巴比妥酸,在100 ℃下沸水浴15 min,冷却后在532 nm下测定吸光值,用PBS调零。对脂质过氧化的抑制作用公式如下:

式中,A0为空白对照液的吸光值,Ai为加入样品溶液后的吸光值。

1.3 数据处理

采用SPSS 22统计软件对数据进行处理,实验结果以平均值±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两组均数之间采用q检验,实验重复3次,结果取平均值。相关性及显著性分析采用SPSS 22统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 四种小浆果浆汁的固形物含量

蓝靛果、树莓、蓝莓、黑果腺肋花楸四种小浆果按照相同的制备方式得到浆汁样品,测得可溶性固形物含量依次为153.2、116.1、188.1和127.2 mg/mL,后续的活性实验通过将其稀释合适的倍数得到的固形物含量来作为参与反应的质量浓度。

2.2 四种小浆果浆汁活性成分比较

四种小浆果浆汁的活性成分研究结果见表1。四种小浆果浆汁的活性成分含量差异显著(p<0.05),同时,与树莓、蓝莓、黑果腺肋花楸相比,蓝靛果的多酚、SOD活力、花色苷以及总黄酮含量都是最高的,有相关文献报道花青素-3-葡萄糖苷是浆果品种中最突出的花青素,Chen等人[24]发现蓝靛果中花青素-3-葡萄糖苷含量高于其他浆果,如蓝莓,黑莓和覆盆子,Hwang等人[25]也发现蓝靛果提取物总多酚含量显著高于花楸果和蓝莓提取物,这与本实验结果是一致的,从表1的数据可以看出蓝靛果的多酚、SOD酶和总黄酮是其他三种小浆果含量的1.5～7倍,花色苷(3.768 mg/mL)则是黑果腺肋花楸含量的14倍左右,说明蓝靛果含有更丰富的天然活性成分,凸显了其在医疗、保健食品、化妆品行业中潜在的应用价值。

表1 四种小浆果浆汁活性成分含量Table 1 Active components content of four kinds of small berry juices

2.3 四种小浆果浆汁体外抗氧化活性比较

2.3.1 ·OH自由基的清除能力 ·OH自由基被看作氧化代谢的有毒副产物,在生物体内具有极高的反应活性,是活性氧中最活泼的自由基,能够导致细胞代谢、功能和结构的改变[26]。以VC为阳性对照,四种小浆果浆汁对·OH自由基的清除效果如图1所示,由图可知,各浆果浆汁及VC对·OH自由基的清除率随质量浓度增加而增大,四种小浆果浆汁的清除活性存在一定的差异,效果均低于VC,VC对·OH自由基的IC50值为0.213 mg/mL(50%清除率所需样品浓度),蓝靛果、黑果腺肋花楸、树莓和蓝莓IC50值分别为2.066、3.017、11.208和9.641 mg/mL。当加入的质量浓度为4 mg/mL时,蓝靛果和黑果腺肋花楸对·OH自由基清除率可达到93.27%和70.45%,对·OH自由基清除效果具有明显优势。

图1 四种小浆果浆汁对·OH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of four kinds of small berry juices on OH radical

图2 四种小浆果浆汁对自由基的清除效果Fig.2 Scavenging effect of four kinds of small

2.3.3 DPPH·自由基的清除能力由图3可以看出,四种小浆果浆汁对DPPH·自由基的清除率随质量浓度的增加而增强,且具有明显的量效关系,VC亦之。四种浆果浆汁之间清除活性存在一定差异,VC对DPPH·自由基的清除效果要优于这四种小浆果浆汁,VC的IC50值为17.999 μg/mL,蓝靛果、黑果腺肋花楸、树莓和蓝莓的IC50值分别为61.342、79.190、114.453和127.536 μg/mL。蓝靛果和黑果腺肋花楸对DPPH·自由基具有良好的清除活性,当质量浓度为150 μg/mL时,蓝靛果和黑果腺肋花楸对DPPH·自由基的清除率可达到96.01%和86.94%。由于小浆果的浆汁仍只是粗提取,若做进一步纯化处理,将会缩小与VC的差距。

图3 四种小浆果浆汁对DPPH·自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of four kinds of small berry juices on DPPH radical

2.3.4 抗卵黄脂蛋白过氧化能力脂质过氧化会产生有细胞毒性的脂质过氧化物,会破坏人体细胞正常生理功能,促使人体衰老和诱发癌症。由图4可知,以VC为阳性对照,四种小浆果浆汁对卵黄脂蛋白过氧化均有抑制效果,且随着质量浓度的增大抗氧化活性也在增强。四种小浆果抗脂质过氧化活性存在差异,当质量浓度为100 μg/mL时,蓝靛果、黑果腺肋花楸、树莓和蓝莓对脂质过氧化抑制率分别为42.78%、29.35%、10.44%和6.91%,而相同质量浓度下VC对脂质过氧化抑制率为9.44%。随着质量浓度的增大,VC的抗氧化效果明显增强,而小浆果抑制氧化反而不够明显,可能是由于浆果浆汁本身的颜色干扰了吸光度的测定，从而影响了活性结果。蓝靛果和黑果腺肋花楸具有较明显的优势,其中VC的IC50值为160.856 μg/mL,蓝靛果、黑果腺肋花楸、树莓和蓝莓的IC50值分别为181.590、196.732、321.342和394.421 μg/mL。

图4 四种小浆果浆汁抗脂质过氧化效果Fig.4 Anti-lipid peroxidation effect of four kinds of small berry juices

表2 活性成分含量与抗氧化活性的相关性Table 2 Correlation between active components content and antioxidant activities

3 结论

本实验对小浆果浆汁的活性成分比较研究中发现四种东北特产小浆果浆汁活性成分含量差异显著(p<0.05),相比之下蓝靛果含有更高含量的天然活性成分,蓝靛果的多酚、SOD酶和总黄酮含量是蓝莓,树莓及黑果腺肋花楸的1.5～7倍,而花色苷含量则高达黑果腺肋花楸的14倍左右,这也符合蓝靛果具有高花青素含量的文献报道。