6株拮抗细菌对哈密瓜细菌性果斑病的大田防效

武 芳，李 勇，路兆军，王 敏，盛玉婷

（1.烟台地元生物科技有限公司，山东 烟台264000；2.海阳市农业技术推广中心，山东 海阳 265100；3.烟台市林业科学研究所，山东 烟台264000；4.鲁东大学 农学院，山东 烟台 264000）

哈密瓜细菌性果斑病是由革兰氏阴性细菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种 (Acidovorax avenaesubsp. citrulli)引起的一种毁灭性病害，并且也是一种危险性检疫病害，该病最早于1969年由Crall和Schenck在美国佛罗里达州发现，之后成为全世界的西瓜种子、幼苗和果实的一种严重威胁，被侵染的种子是重要的初侵染源，可造成西瓜细菌性果斑病的大面积暴发。且近些年来，其他瓜类作物，如哈密瓜、黄瓜、南瓜和西葫芦等瓜类作物上也检测到了该病害的发生。

内蒙古巴彦淖尔市从1991年开始从新疆引种种植哈密瓜，种植面积高达13.3万hm2，每年种植的品种有40～50个。因为其广泛的种植面积，为细菌性果斑病的发生提供了基础，在20世纪末开始发生该病害，每年生产田发病率45%～100%，经济损失严重，并有上升趋势，已成为哈密瓜产业发展的首要障碍，所以，防治该病害的发生成为一种亟待解决的问题。

随着社会的发展，经济水平的提高，人们越来越关注食品安全，传统的化学农药因为其污染环境并且高残留的特点，逐渐成为人们排斥的对象，而环境友好型的生物农药才是发展的趋势。本试验旨在研究拮抗菌株对哈密瓜细菌性果斑病的防治效果，从中筛选得到对该病有较好生防作用的菌株，为生产实践奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验植物

本试验所选品种为金蜜十号，由新疆宝丰种业有限公司研制，该品种属中早熟哈密瓜品种，全生育期85 d左右，植物生长势中等，果实椭圆形，金黄色底上覆有墨绿色斑点，中粗网纹布满全瓜，桔红肉，肉质较脆、蜜甜，风味佳，综合抗性好，较耐霜霉病、抗白粉病，易感细菌性果斑病，种植区域广泛。

1.2 试验药剂

72%的农用链霉素，由华北制药股份有限公司生产；王酮·代森锌，由保加利亚艾格利亚有限公司生产。

1.3 供试生防菌株和培养基

生防菌株如表1中所示，菌株均来源于本公司实验室细菌菌株库。培养基：LB培养基（由南京基天生物技术有限责任公司生产）。

表1 供试拮抗菌菌株

1.4 6株生防菌株培养方法及菌液的制备

培养方法：于-70 ℃冰箱中取出原始菌株，在LB平板上划线，28 ℃下培养24 h，待长出单菌落，挑取其接入含有5 mL LB 培养液的试管中，28 ℃、200 r/min培养24 h，制成种子液；以1%的接种量将种子液接种于装有500 mL LB 培养液的1 L规格的大三角瓶里，28 ℃、200 r/min培养22～24 h。待菌液制备好之后，6 000 r/min离心30 min，弃上清液，用无菌水将沉淀重悬浮，终浓度调试为1×108cfu/mL备用。

1.5 6株拮抗细菌对哈密瓜苗期的促生试验

本试验共设置8个处理，分别为1：生防菌DY54；2：生防菌DY03；3：生防菌DY13；4：生防菌DY02；5：生防菌DY21；6：生防菌DY20；7：王酮·代森锌；8：清水对照。每个处理4次重复，每个小区20 m2（约种植26棵瓜苗），采用随机区组排列，各小区间设置适当宽度的隔离行。在种子播种之前，首先用为72%的农用链霉素进行消毒处理10 min，晾干后播种。待瓜苗长到2片真叶时，用1×108cfu/mL生防菌液进行处理。采用灌根和喷雾同时处理的方法，即在瓜苗2片真叶时，在瓜苗根围缓缓灌入20 mL的生防菌液同时将生防菌液喷施到叶片的正反两面，每隔15 d处理一次，在种植后35 d时统计其促生效果，按照5点取样法，对瓜苗的茎粗、茎长和叶片数进行统计。

1.6 6株拮抗细菌对哈密瓜细菌性果斑病的防效试验

菌液处理方法同上，待哈密瓜开始发病后，统计其病害，病害分级共有0、1、2、3、4、5、6共7个等级，分级标准如下：

0级：不发病；

1级：病叶上有零星病斑，病斑占叶面积的10%以下；

2极：病叶上有少量病斑，病斑占叶面积的11%～25%；

3级：病叶上病斑数量中等，病斑占叶面积的26%～50%；

4级：病叶上病斑数量较多，病斑占叶面积的51%～75%；

5级：病叶上有许多病斑，病斑占叶面积的76%～90%；6级：病叶上有大量病斑，病斑占叶面积90%以上；病害严重度=[Σ (病级叶片数×代表级数)／叶片总数×最高代表级值]×100%；

防效=(对照发病率－处理发病率)／对照发病率×100%。

1.7 6株拮抗菌株对哈密瓜果实产量的影响

在果实成熟后，对每个小区的哈密瓜果实产量进行统计，并计算其产量增加量。

产量增加量=（处理组果实质量-对照组果实质量）/对照组果实质量×100%。

1.8 6株拮抗菌株对哈密瓜果实品质的影响

哈密瓜果实成熟后，在每个小区按照五点取样法选取5颗果实，即每个处理共选择20颗果实进行品质检测，其中哈密瓜的可溶性糖、可溶性蛋白质、维生素C含量测定参照《植物生理生化实验原理和技术》中提供的方法，其可溶性固形物含量用手持测糖仪（WXY2I型）进行检测，果肉硬度用果实硬度计（GY-B型）测定。

1.9 大田试验中病原菌的鉴定

在田间采集哈密瓜病害叶片，采用平板划线分离法进行分离。取病健交界处的组织4～5 mm，先在75%的酒精里浸泡10 s，再用0.001%的升汞中消毒2～3 min，后用无菌水漂洗3次，然后将组织碾碎到1～2 mL的无菌水中，梯度稀释，用接种环蘸取菌悬液在LB平板上划线，在28 ℃条件下培养24 h，挑取单菌落到含有5 mL LB培养液的试管中，28 ℃、200 r/min培养22～24 h。

用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rDNA扩增通用引物U8-27 [5′-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3′]、L1494-1514 [5′-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3′]从 基 因 组 DNA 中 扩增出16S rDNA基因片段，将片段产物克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α后，挑取阳性单克隆，培养，送到测序公司测序，并BLAST比对。

2 结果与分析

2.1 6株拮抗细菌对哈密瓜苗期的促生结果

在哈密瓜种植35 d后对其茎粗、茎长和叶片数进行统计，结果表明，各处理组中哈密瓜的茎粗、茎长和叶片数较清水对照组均有不同程度的增加，而与药剂组相比，只有DY54、DY03和DY20 3个处理组中哈密瓜的茎粗、茎长和叶片数有所增加（表2）。

表2 6株拮抗细菌对哈密瓜苗期的促生结果

2.2 6株拮抗细菌对哈密瓜细菌性果斑病的防效结果

在哈密瓜种植60 d后，细菌性果斑病发病达到高峰，对其发病指数和发病率进行统计、计算，结果表明，各处理组的病害严重度和发病率均低于清水对照组，并且处理组DY54、DY03的病害严重度和发病率也低于药剂组（表3、图1）。根据对其整个发病期的发病指数的统计结果进行计算（图2），发现拮抗细菌DY54和DY03能够延迟病害的发生，拮抗细菌DY54可延迟4 d，DY03可使病害延迟2 d；8月初是该病害迅速发生的时期，应采取更进一步的防治措施来控制该病害的传播。

表3 6株拮抗细菌对哈密瓜细菌性果斑病的防效结果

表4 6株拮抗细菌对哈密瓜果实产量的影响

图1 6株拮抗细菌对哈密瓜细菌性果斑病的防效

图2 6株拮抗细菌处理组病害严重度趋势

2.3 6株拮抗菌株对哈密瓜果实产量的影响

在哈密瓜果实采收时，对果实进行称质量，经统计计算，各处理组对果实的产量也有一定的促生作用，并且相对于化学对照组，除处理组DY21以外，其他能使哈密瓜的果实产量增加(表4)。

2.4 6株拮抗菌株对哈密瓜果实品质的影响

哈密瓜果实成熟后，对其可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可溶性固形物含量和果肉硬度等指标进行检测，结果表明，各处理组也可在一定程度上改善果实的品质，尤其在可溶性固形物含量这一指标上表现明显，并且相对于药剂组，拮抗细菌DY54和DY03能够提高果实品质的所有指标 (表 5)。

2.5 病原菌的鉴定结果

在病害发生的同时，对其病叶进行采集，经分离鉴定，有约1 500 bp大小的16S roNA片段，经测序、比对，与登录号为NR 041758.1的菌株Acidovorax citrullistrain ICMP 7500 相似度达到99%。由此确定，田间发生的病害为由燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)引起的细菌性果斑病。

表4 6株拮抗细菌对哈密瓜果实品质的影响

图3 病原菌的16SrRNA扩增结果

3 结论与讨论

自细菌性果斑病发现以来，因为其危害重、传播快，对瓜类生产造成了严重损失，成为人们研究的热点，但一直以来都没有找到有效的防治措施。生物防治作为一种新兴的防治手段，成为人们的希望所在。但是在此方面研究相对还比较少，大多局限在平板拮抗或试验条件易控制的温室防效阶段，Fessehaie和walcott采用Pseudomonas fluorescens(A506)、非致病菌A.avenaesubsp.avenae(AAA99-2)和从瓜种上获得的1株未鉴定的革兰氏阴性细菌WS-1在西瓜花期进行接种，经试验，结果表明P. fluorescens(A506)和A. avenaesubsp.avenae(AAA99-2)具有很好的生防效果，并且能有效阻止细菌性果斑病菌侵染种子，同时还发现A.avenaesubsp.avenae(AAA99-2)这一菌株可以提高种子的发芽率，所以认为其具有良好的发展前景。泰国和巴西也相继报道了用生防菌来抑制细菌性果斑病菌的发展，他们利用Bacillus mageteriumpv.cerealisRAB7、Streptomyces-84和-87进行平板拮抗测定，表现出了良好的抑菌效果，但并没有深入的做下去。前人报道了用酵母菌来防治细菌性果斑病，取得了良好的效果，但是其并没有进行大田试验，不能充分说明该菌的生防效果及稳定性。

以上研究结果表明，试验中所选用的几株拮抗菌株对细菌性果斑病的防治均有一定的效果，本研究所选用的拮抗菌株大多是芽孢杆菌，这可能是因为芽孢杆菌为土壤和植物微生态优势种群，有极强的抗逆性，被认为是一类理想的生防菌。前人用芽孢杆菌BB11、FH17来防治辣椒疫病，达到了55.8%和37.1%的防效；用芽孢杆菌防治番茄青枯病，取得了高达90.18%的防效。这些都说明芽孢杆菌是一类极具生防潜力的菌株，可能是由于芽孢杆菌能够诱导植株产生系统抗性所致。另外一株拮抗菌株黏质沙雷氏也表现出了一定的生防效果，由沙雷氏菌防治番茄青枯病的研究一致。但是拮抗作用究竟在以什么样的方式起作用，还有待进一步研究。