GC-O-MS法对比脐橙果酒和脐橙蒸馏白酒的香气活性成分

胡丽香，王丽金，宋焕禄，陈岳林，金永春 ，张秉海

（1.北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京100048；2.瑞金客佳红酿造股份有限公司，江西瑞金342500）

脐橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck)，又名甜橙、香橙、橙子，属双子纲，芸香科，常年葱绿隶属小乔木，是世界各国竞相栽种的优良柑橘品种。脐橙富含人体所需营养物质，是优良的绿色营养丰富的保健食品[1]。据中医记载，脐橙具有疏理通气、生津止渴、健胃消食的功效，经常食用可减肥健体、清火养颜、降低胆固醇、尽可能地抑制有色金属和放射性元素在人体内积累，对防癌抗癌也有一定作用[2]。在我国，部分地区拥有成熟的优良脐橙品种栽培技术，如江西的赣州，其脐橙的规模已然跃居世界第三和全国第一的位置[3]。面对着逐年攀升的产量，脐橙作为水果鲜食这种产品结构已无法与其巨大的产量相匹配，容易出现果实滞销、保鲜期短的困难[4]。目前，脐橙精深加工业发展滞后，低端产品过多，高端产品较少。因此，提高脐橙精深加工水平，开发脐橙深加工产品，加大脐橙深加工量刻不容缓[5]。而脐橙中存在的高级醇、醛、酮、酯等挥发性香气成分对脐橙深加工产品的质量影响巨大。因此，对脐橙深加工产品中挥发性香气成分的分析、了解与控制环节至关重要。

随着社会的发展与进步，人们对酒的需求逐渐多样化，不仅需要高度的蒸馏酒，低度的酿造酒也越来越受欢迎，同时对酒品质的要求也不断提高[6]。而脐橙果酒是以脐橙鲜果或果汁为原料，经酵母发酵后过滤得到的澄清的低醇饮料[7]。在保留脐橙中各种无机盐、维生素、蛋白质、脂肪等营养成分和果香的同时，引入了酵母发酵产生的特殊发酵风味，口感温和爽滑[8]。脐橙蒸馏白酒是在发酵的基础上，进一步蒸馏得到的高度酒，具有蒸馏白酒酒香的同时，保留有部分脐橙的特色风味。因此，脐橙果酒和脐橙白酒作为具有特色的脐橙深加工产品，存在着较大的市场潜力。

目前，已有一些对脐橙深加工产品如脐橙果汁和脐橙果酒香气成分研究的报道。现有的研究多是基于气相色谱-质谱（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，如李晓英等[9]利用溶剂萃取法结合GC-MS对脐橙果汁和果酒的香气成分的分析，刘琨毅等[10]利用GC-MS研究了不同柑橘品种对柑橘果酒香气成分的影响，郭莉等[11]对于贮藏过程中夏橙汁香气成分的变化进行了分析。然而，并不是所有的可挥发性成分对脐橙果酒和脐橙白酒的香气都有贡献[12]。其中不乏一些含量高，但其阈值也较高的挥发性成分，对脐橙果酒和脐橙白酒的香气表现影响并不大。同时，也存在一部分含量极低、但阈值也极低的香气成分，其香气贡献颇大，是脐橙果酒和脐橙白酒的香气组成中不可缺少的部分。本研究是基于气相色谱-嗅闻-质谱联用技术（GC-olfactometry-MS，GC-O-MS），即在GCMS的基础上，结合嗅闻对脐橙果酒和白酒的香气成分进行分析。GC-O-MS分析仪器利用人机结合的方式，通过鼻子的嗅闻，直接对经GC分离后的单体香料的呈味特性进行分析，是迄今为止气味化合物鉴定最为经典的一种方式[13]。此外，为了更准确地研究脐橙果酒和脐橙白酒中关键的香气成分，本研究利用香气成分稀释分析（Aroma extract dilution analysis，AEDA）法，即将香气提取物进行连续稀释，再分别利用GC-O-MS进行分析，直到完全无法嗅闻到气味为止。由此，本研究以探索脐橙果酒和脐橙白酒中的真正具有香气活性的成分为目的，为从风味上改进脐橙果酒和白酒酿造工艺，提高其产品品质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：脐橙果酒（12%vol）和脐橙白酒(53%vol)，江西瑞金客佳红酿造股份有限公司提供。

内标：2-甲基-3-庚酮，由SIGMA-ALDRICH公司提供。

正构烷烃系列标品：C7—C30，由北京普惠沃野能源技术有限公司提供。

仪器设备：固相微萃取装置（SPME手柄、50/30 μmDVB/CAR/PDMS 萃取头），美国 Supelco公司；Agilent 7890A/7000C GC-MS联用仪，美国安捷伦公司；Sniffer 9000嗅闻检测仪，瑞士Brechbuhler公司；HH-1恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固相微萃取

1.2.1.1 脐橙白酒样品的处理

将脐橙白酒用超纯水稀释5倍后，取6 mL于40 mL的顶空瓶内，加入1.0 g NaCl和1 μL内标，盖上顶空瓶盖，在60℃的恒温水浴锅内平衡20 min，然后将50/30 μm的DVB/CAR/PDMS香气成分萃取头插入顶空瓶内，吸附40 min后拔出萃取头，迅速插入GC进样口解吸5 min，接着进行GC-O-MS分析。

1.2.1.2 脐橙果酒样品的处理

取脐橙果酒6 mL于40 mL的顶空瓶内，加入1.0 g NaCl和1 μL内标，重复1.2.1.1中的平衡，吸附、解吸等操作。

1.2.2 GC分析

色谱柱：极性Agilent DB-Wax(50 m ×250 μm×0.25 μm)的弹性石英毛细管柱；进样口温度：250 ℃；分流比：10∶1；载气：高纯度的氦气（99.9999%）；流速：1 mL/min；升温程序：起始温度50℃，保持3 min，运行3 min，以4.8℃/min升温到200℃，运行36.33 min，然后以10.0℃/min升温到250℃，保持3 min，共运行42.33 min。

1.2.3 MS分析

离子源：EI源；离子源温度为230℃；接口温度：280℃；电子轰击的能量为70 eV；溶剂延迟4 min；质量扫描范围：全扫描。

1.2.4 GC-O分析

选取经过专业闻香培训的品评人员对本实验中的样品进行GC-O分析和香气提取物稀释分析。

1.2.5 香气提取物稀释分析（AEDA）

对脐橙果酒和脐橙白酒的香气提取物分别按照1∶21、1∶22、1∶23、1∶24……进行稀释[14]，每一次稀释后的样品都利用GC-O进行嗅闻分析，直到嗅闻不到为止，停止稀释。初始样品中香味化合物的浓度与最大稀释后的样品中该化合物的浓度的比值，即稀释倍数，被称为稀释因子（Flavor dilution factor，FD值）。FD因子越大，表明该气味越关键。

表1 脐橙果酒与脐橙白酒香气成分表

1.2.6 化合物的鉴定方法

定性分析：采取NIST14标准谱库检索、保留指数比对和嗅闻3种方法进行定性。

定量分析：本实验选取2-甲基-3-庚酮作为内标，配制内标溶液，其浓度作为已知量，通过Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件读出的峰面积，结合特定公式C1/C2=A1/A2（C：表示浓度，单位μg/L；A：表示化合物峰面积），即可对相应香气化合物进行定量。

1.2.7 保留指数的测定

取1.0 μL正构烷烃系列标品混样，采用直接进样的方式，通过GC-MS进行分析，获得各个烷烃相应的保留指数，结合公式即可计算出每种香气化合物的保留指数（Retention index,RI）[15-16]。

2 结果与分析

2.1 脐橙果酒的香气成分结果分析（表1）

由表1可知，脐橙果酒中检测出11种醇类，9种酯类，3种醛类，2种酸类，共25种香气成分。醇类物质占香气成分的比例最大，为72.65%，酯类物质占香气成分的18.44%，醛类物质占比为5.36%，酸类物质占比最少为3.55%。通过对脐橙果酒进行香气成分稀释分析，可知脐橙果酒的关键香气成分共10种，且主要是醇类和酯类物质（表1，图1）。其中稀释因子在8及8以上的包括具有苹果味的丁酸乙酯和甲基丁酸乙酯、具有果香味的辛酸乙酯等3种酯类，以及具有酒精味的丙醇、坚果味的己硫醇、花香味的芳樟醇和具有玫瑰花味道的2-苯乙醇，共4种醇类。脐橙果酒中香气呈味最浓烈的为具有坚果味的己硫醇，其稀释因子达到了2048，其对脐橙果酒的香气贡献最大。已有研究报道表明，己硫醇是酱香型白酒中的主要含硫香气成分之一[17]，在脐橙果酒中己硫醇是首次检出。虽然己硫醇呈香作用显著，但其含量却极低，仅为2.56 μg/L±0.91 μg/L，远小于含量为579.70 μg/L±190.12 μg/L的戊醇（稀释因子为2），同时，辛醇含量却高达763.21 μg/L±176.88 μg/L，然而在稀释到21倍后闻不到该化合物的特征性气味。由此可知，一种香气成分的呈香关键性与其含量高低无关。在所有酯类成分中，具有菠萝味的乙酸乙酯的含量最高为212.13 μg/L±67.55 μg/L，其次是具有果香味的琥珀酸二乙酯含量为103.24 μg/L±36.94 μg/L，然而，这两者同上述辛醇一样，在稀释到21倍后已闻不到该化合物的特征性气味。

2.2 脐橙白酒的香气成分结果分析

图1 脐橙果酒香气提取物稀释分析图

图2 脐橙白酒香气提取物稀释分析图

由表1可知，脐橙白酒中检测出10种酯类，6种醇类，2种醛类，3种萜烯类和对伞花烃，共22种香气成分。萜烯类占比最大，为50.00%，酯类物质占香气成分检出物的34.57%，醇类物质占15.14%，醛类物质占0.28%，对伞花烃占0.01%。在所有酯类成分中，癸酸乙酯的含量最高为1673.78 μg/L±292.96 μg/L，其次月硅酸乙酯的含量为600.24 μg/L±193.77 μg/L，十六烷酸乙酯的含量为124.57 μg/L±44.24 μg/L。另外，脐橙白酒的醇类香气成分中，戊醇、辛醇和2-苯乙醇三者的含量较高，分别为782.90 μg/L±16.27 μg/L、180.15 μg/L±41.08 μg/L、177.45 μg/L±20.10 μg/L。萜烯类中具有油香味的巴伦西亚橘烯的含量是所有成分中含量最高的物质，达到 3700.30 μg/L±148.45 μg/L。稀释分析结果（图2）表明，脐橙白酒中的关键香气成分共4种：其中2-苯乙基乙酸酯和2-苯乙醇的稀释因子均为4，丁酸乙酯的为8，己硫醇的稀释因子最大为16，即具有坚果香味的己硫醇是脐橙白酒的最关键的香气成分。

2.3 脐橙果酒和脐橙白酒香气成分分析结果对比

在脐橙果酒和脐橙白酒中共检测出7种酯类，5种醇类和2种醛类共14种共同的香气成分，主要表现为菠萝、苹果、香蕉等果香味，玫瑰等花香味，醋酸味，溶剂味、坚果味，焦糊味和汗臭味。其中具有坚果味的己硫醇在脐橙果酒和脐橙白酒中稀释因子均最高，其对脐橙果酒和脐橙白酒的香气组成影响均较大，是关键香气成分。

2.3.1 酯类香气成分的比较

酯类物质是由醇和酸经过酯化作用而产生的，酯类物质所具有的独特的果香、花香使得其在各种酒品的香气组成中占有重要地位[18-19]。在脐橙果酒和脐橙白酒中均检测出了乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、月桂酸乙酯等7种酯类物质，而这7种酯类在脐橙果酒中占总香气成分的15.76%，在脐橙白酒中占总香气成分的36.34%，其中，各种酯类在脐橙果酒和脐橙白酒中含量的差异也较大，如乙酸乙酯在脐橙果酒中的浓度为212.13 μg/L±67.55 μg/L，在脐橙白酒中降低到了40.83 μg/L±7.46 μg/L，而在脐橙果酒中浓度相对较低的月桂酸乙酯在脐橙白酒中的浓度达到了600.24 μg/L±193.77 μg/L。除了共有的酯类物质，二者还具有各自的特色香味。如脐橙果酒中检测出的甲基丁酸乙酯具有苹果味，琥珀酸二乙酯具有独特成熟的果香味，在脐橙白酒中却并未检测到。而具有果香味的己酸乙酯和蜡味的十六烷酸乙酯仅在脐橙白酒中被检测到。综上，所含酯类含量的差异和种类的不同使脐橙果酒和脐橙白酒的香气组成存在较大差异。

2.3.2 醇类香气成分的比较

醇类物质通常来源于酵母的糖代谢和氨基酸代谢过程[20]，此外，还有部分经莽草酸在酵母体内代谢合成，因此醇类物质的风味主要集中在酵母发酵的发酵香味[21]，如辛醇和糠醇的焦糊香味（类似于发酵面包的焙烤香味），2-苯乙醇清甜的玫瑰花香，α-萜品醇的薄荷清新，己硫醇的坚果香，芳樟醇的花香，以及反式香芹醇的溶剂味等。以上各种代表性的醇类香气，大大增加了酒品的风味特色。其中2-苯乙醇是苯丙氨酸经上述氨基酸代谢过程而形成的[22]。本实验检测出的脐橙果酒和脐橙白酒共同含有戊醇、己硫醇、辛醇、反式香芹醇、2-苯乙醇等5种醇类，其在两者的香气成分中的含量存在较大差异（表1）。如具焦糊味的辛醇和玫瑰花味的2-苯乙醇在脐橙果酒中的含量分别为763.21 μg/L±176.88 μg/L和313.06 μg/L±89.09 μg/L，在脐橙白酒中分别降低至180.15μg/L±41.08μg/L和177.45μg/L±20.10 μg/L。而戊醇、己硫醇等在两种酒品中的含量差异极小。此外，仅在脐橙果酒中检测出的具有中药味的丁醇，花香味的芳樟醇，油香味的1-萜品烯-4-醇，焦糊味的糠醇以及薄荷味的α-萜品醇。醇类香气组成的复杂性使脐橙果酒的风味较脐橙白酒更为多元化。

2.3.3 有机酸类等其他香气成分的比较

在本研究中，有机酸类香气成分在脐橙白酒中未被检测到，而在脐橙果酒中仅有醋酸和辛酸两种有机酸被检测到。醋酸的典型风味是酸味，辛酸具有轻微的汗臭味。酵母代谢可产生有机酸，但却极易与果酒中的醇类物质发生酯化反应生成羧酸酯[23-24]。因此，在脐橙果酒中检测到的有机酸含量较低，且在脐橙白酒中并未检测到。此外，仅在脐橙白酒中检测到具有柑橘香味的D-柠檬烯，刺激性气味的对伞花烃，青草味的β-芹子烯和油香味的巴伦西亚橘烯，其中巴伦西亚橘烯的含量较高，为3700.30 μg/L±148.45 μg/L，D-柠檬烯的含量为360.45±3.42 μg/L，β-芹子烯的含量为59.18 μg/L±13.52 μg/L，相比之下，对伞花烃的含量较低，仅为1.05 μg/L±0.43 μg/L。总的来看，尽管这些物质含量较高，但由稀释分析结果可知，有机酸等其他香气成分的稀释因子均小于2（图1和图2）。因此，有机酸不是脐橙果酒和脐橙白酒中的关键香气成分。

3 结论

本实验采用顶空固相微萃取法对待测的脐橙果酒和脐橙白酒样品进行前处理，结合稀释分析，经GC-O-MS技术分析，由质谱数据、嗅闻结果和计算出的保留指数，从脐橙果酒和脐橙白酒里共鉴定出33种香气化合物，包括12种醇类、12种酯类、3种醛类、2种酸类、3种烯萜类和对伞花烃。其中丁酸乙酯、甲基丁酸乙酯、丙醇、己硫醇、芳樟醇、2-苯乙醇、反式香芹醇、2-苯乙基乙酸酯、戊醇等对脐橙果酒香气的贡献较大，前6种的稀释因子都在8或者8以上。而对脐橙白酒香气贡献较大的化合物相对较少，主要有丁酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、己硫醇、2-苯乙醇。总的来看，己硫醇在脐橙果酒中的稀释因子达到2048，在脐橙白酒中达到16，是这两种酒品中最关键的香气成分。正是这些香气成分在脐橙果酒和脐橙白酒中含量及种类的不同，构成了脐橙果酒和脐橙白酒独特的风味。本研究可为提高脐橙果酒和脐橙白酒的品质提供参考，推动脐橙深加工产业的发展。