巴戟天微型饮片工艺优选

魏晓峰　任晓航　李祥溦　刘博男　史辑　贾天柱

摘要：目的 优选巴戟天微型饮片切制工艺参数，探讨其是否适用于不同产地来源的巴戟天。方法 以蒸制时间、饮片长度、饮片厚度、烘干温度为影响因素，以水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、耐斯糖的含量及出膏率、休止角为评价指标，采用正交试验优选巴戟天微型饮片切制工艺，并建立不同产地来源巴戟天微型饮片HPLC指纹图谱。结果 巴戟天微型饮片最佳切制工艺为：常压蒸制软化30 min，切片长度3 mm，切片宽度1～2 mm，40 ℃烘干。结论 巴戟天微型饮片软化切制工艺简单易行，具有良好的适用性。

关键词：巴戟天；微型饮片；切制工艺；正交试验；高效液相色谱法

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）03-0065-06

Abstract： Objective To optimize cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces； To investigate whether the cutting technology was suitable for Morindae Officinalis Radix from different producing areas. Methods Steaming time， length of decoction pieces， thickness of decoction pieces， and drying temperature were set as influencing factors， and the contents of crystal lanolin， deacetyl levulinic acid， methyl isophorin-1-methyl ether， methyl isophorin， nes sugar， and the rate of ointment and angle of repose were set as evaluation indexes. The orthogonal test was used to optimize the cutting process of Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces， and HPLC fingerprints of Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces from different producing areas were established. Results The optimal cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces was steaming 30 min， then cutting into 3 mm length and 1–2 mm width， and the drying temperature was 40 ℃. Conclusion The optimal cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces is easy to conduct， with good applicability.

Keywords： Morindae Officinalis Radix； miniature decoction pieces； cutting process； orthogonal test； HPLC

飲片是中药根据需要炮制处理而成的，可直接供临床使用。饮片质量好坏直接影响着中药方剂、汤药的临床疗效[1]。目前《中华人民共和国药典》只对饮片的片、块、丝、段、厚度等进行了相关规定，并未对饮片片型、大小等具体参数进行明确规定，因此饮片市场常遵循“以大为优”的原则[2]。规格较大的饮片并不利于中药有效成分煎出，反而导致临床药效不明显。随着现代生活节奏的加快，中药汤剂煎煮服用方式已不能满足患者的需求。市场上出现了诸如颗粒、超微、配方颗粒、单味浸膏颗粒、破壁[3]等多种形式的饮片，突破了传统饮片携带不方便、煎煮费时费力的局限性，但以上多种饮片形式却忽视了一个最重要环节——共煎过程，即根据中药相须、相使、相恶、相杀、相畏、相反的“七情”配伍规律，多种化学成分之间的反应均需在煎煮过程中完成，由此产生了微型饮片的概念。微型饮片是直径在0.5～1.0 cm的丁块状饮片，其片型小于传统饮片，煎出率高于传统饮片[4]。我们期望通过微型饮片改革，制备出规格划一、流动可调，能够智能配方的饮片，使中药调剂接近西药调剂，较传统饮片更有利于有效成分煎出。

本研究以“四大南药”之一的巴戟天为对象，对其微型饮片的软化、切制工艺进行优选。巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，具有强筋骨、补肾阳、祛风湿功效。临床常用于筋骨萎软、宫冷不孕、少腹冷痛、风湿痹痛、月经不调等症[5]。巴戟天主要含有蒽醌、环烯醚萜苷、多糖、寡糖等类成分[6]。近年来，巴戟天由于其补肾壮阳[7]、抗衰老、防抑郁[8]、调节免疫[9]等作用，成为新药研发的热点。巴戟天主产于广东、广西、福建、海南等省，不同产地巴戟天由于加工工艺不同，导致其饮片性状差异较大，形状、长度均不一致。因此，本研究采用正交试验对巴戟天微型饮片的软化、切制工艺进行研究，并建立不同产地来源的巴戟天微型饮片的特征图谱，考察巴戟天微型饮片工艺的可行性。

1 仪器与试药

E2695-2998型高效液相色谱仪，美国Waters公司；H-Class/Xevo TQD型三重四级杆液相质谱联用仪（配有MassLynx色谱工作站），美国Waters公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山市超声仪有限公司；AE240型1/10万电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；RE52CS型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH-S4型水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；101型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂。

巴戟天药材来自10个产地，分别为广西玉林（S1）、广西百色（S2）、广东惠州（S3）、福建永定（S4）、广东韶关（S5）、广东梅州（S6）、广东肇庆（S7）、福建南靖（S8）、广东德庆（S9）、湖南湘西（S10），经辽宁中医药大学药学院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定，均为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。

耐斯糖对照品（批号292-64121，纯度≥99.0%，日本Wako公司），水晶兰苷对照品（批号O0605AS，纯度≥98.0%，大连美仑生物技术有限公司），去乙酰车叶草甘酸对照品（批号J0329AS，纯度≥98.0%，大连美仑生物技术有限公司），甲基异茜草素-1-甲醚对照品（自制，纯度>95.0%），甲基异茜草素对照品（自制，纯度>95.0%），水为超纯水，乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯（美国Merck公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 耐斯糖含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取耐斯糖对照品1.2 mg，以甲醇-水（3∶97）定容至5 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取巴戟天微型饮片2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加乙酸乙酯30 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，过滤，弃去滤液，滤渣挥干后加70%乙醇50 mL，相同条件下超声处理，过滤，回收乙醇，残渣以甲醇-水（3∶97）定容至25 mL容量瓶中，取续滤液，过0.22 ?m微孔滤膜，即得。

2.1.3 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），负离子模式，流动相为0.1%甲酸-乙腈∶0.1%甲酸-水，体积流量0.3 mL/min，梯洗脱程序见表1，进样量1 ?L。液相色谱-质谱图见图1。

2.1.4 线性关系考察

精密吸取耐斯糖对照品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=207 888X-1456.92，r?=0.999 1，线性范围为0.004 8～0.240 0 mg。

2.1.5 精密度试验

精密吸取同一耐斯糖供试品溶液，在1 d内连续进样6次，连续6 d同一时间分别进样1次，进样体积相同，测得耐斯糖日内峰面积RSD=1.7%，日间峰面积RSD=1.7%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

精密吸取同一耐斯糖供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，耐斯糖峰面积RSD=1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

取同一样品6份，制备供试品溶液，按“2.1.3”项下条件测定，测得耐斯糖含量RSD=1.9%，表明本方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密称取已知耐斯糖含量的巴戟天微型飲片6份，每份1.0 g，按近似1∶1比例加入耐斯糖对照品，按“2.1.2”项下方法制备，计算加样回收率。结果耐斯糖平均加样回收率为99.10%，RSD=1.73%。

2.1.9 样品含量测定

取各组巴戟天微型饮片，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下条件进行测定，进样量1 μL，记录峰面积，计算耐斯糖含量。

2.2 水晶兰苷、去乙酰车叶草甘酸含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取水晶兰苷、去乙酰车叶草甘酸对照品各1.5 mg，用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，即得。用时按1∶1比例配成混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取巴戟天微型饮片1 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，加80%甲醇100 mL，冷浸1 h，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，过滤，滤液减压回收，用80%甲醇定容于10 mL容量瓶中，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.2.3 色谱条件

采用Venusil MP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（5∶95→28.8∶71.2，15 min），检测波长235 nm，体积流量0.8 mL/min，进样量2 ?L，柱温25 ℃[10]。色谱图见图2。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸各2、4、6、8、10 ?L，进样测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果水晶兰苷回归方程为Y=2 000 000X-4430，r?=0.999 9，线性范围为0.300～1.500 mg；去乙酰车叶草甘酸回归方程为Y=2 000 000X+16 844，r?=0.999 9，线性范围为0.300～1.500 mg。

2.2.5 样品含量测定

取各组巴戟天微型饮片，按“2.2.2”“2.2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，进样量2 ?L，记录峰面积并计算水晶兰苷和去乙酰车叶草甘酸的含量。

2.3 甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称取甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素对照品各2.93 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。用时按1∶2比例配制成混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

精密称取巴戟天微型饮片5 g，置于150 mL圆底烧瓶中，加入80 mL氯仿，加热回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，回收氯仿，以甲醇定容至10 mL量瓶中，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，备用。

2.3.3 色谱条件

采用Ecosil8色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脱程序见表2，检测波长为277 nm，流速0.8 mL/min，进样量20 ?L，柱温30 ℃[11]。色谱图见图3。

2.3.4 线性关系考察

精密吸取甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素对照品各3、6、10、13、16 ?L，进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。甲基异茜草素回归方程为Y=5 000 000X+4 000 000，r?=0.999 1，线性范围为1.173～6.256 ?g；甲基异茜草素-1-甲醚回归方程为Y=7 000 000X+4 000 000，r?=0.999 9，线性范围为0.585～3.120 ?g。

2.3.5 样品含量测定

取各组巴戟天微型饮片，按“2.3.2”“2.3.3”項下方法制备供试品溶液并测定，进样量20 ?L，记录峰面积并计算样品中甲基异茜草素-1-甲醚和甲基异茜草素的含量。

2.4 出膏率测定

取不同工艺制备的巴戟天微型饮片适量，粉碎，过2号筛，精密称取4 g，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入100 mL水，冷浸，前6 h内时时振摇，静置18 h，用干燥滤器过滤，精密量取续滤液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，精密称定。

2.5 饮片休止角测定

取一矩形盒子，装满巴戟天微型饮片，使其疏松程度适宜，逐渐倾斜盒子，使饮片开始流动，此时倾斜程度即为饮片休止角θ，tanθ=H/L（H为倾斜角高，L为底边）[12]。

2.6 正交试验设计与结果

采用正交设计方法，以饮片长度、饮片厚度、干燥温度及蒸制时间为考察因素，每因素设置3个水平，用L9（34）正交表设计试验（见表3）。以水晶兰苷、去乙酰基车叶草甘酸、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、耐斯糖总含量（X）及出膏率（Y）、饮片休止角（Z）为评价指标，并将其权重系数分别设定为0.4、0.4、0.2，进行正交试验，计算综合评分。综合评分=0.4X/Xmax+0.4Y/Ymax+0.2Z/Zmax，其中Xmax、Ymax、Zmax为各项指标测定结果的最大值。试验结果见表4，方差分析见表5。

由方差分析可知，蒸制时间和饮片厚度对巴戟天微型饮片切制工艺有显著影响（P<0.05），切制长度及烘干温度无显著影响。综合直观分析及方差分析结果，最终确定巴戟天微型饮片的最佳切制工艺为：常压蒸制30 min后进行切制，切片长度3 mm、宽度1～2 mm，40 ℃烘干。

2.7 验证试验

取3批巴戟天微型饮片（样品1、2、3号）和3份巴戟天传统饮片（样品4、5、6号），1、2、3号样品按“2.6”项下确定的微型饮片切制工艺制备，4、5、6号样品按传统饮片切制工艺（加1.0倍量水于50 ℃闷润9 h，切段长度10～15 mm）制备[10]，分别测量耐斯糖、水晶兰苷、去乙酰车叶草甘酸、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素的含量及出膏率、饮片休止角，计算综合评分，结果见表6。可见，6份样品综合评分均较高，且微型饮片的综合评分均高于巴戟天传统饮片，与正交试验结果相吻合，表明巴戟天微型饮片最佳工艺稳定可行。

2.8 指纹图谱检测方法

2.8.1 色谱条件

采用Ecosil8色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脱程序见表2，检测波长277 nm，流速0.8 mL/min，进样量20 ?L，柱温30 ℃。

2.8.2 对照品溶液的制备

精密称取甲基异茜草素-1-甲醚对照品2.93 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。

2.8.3 供试品溶液的制备

取不同产地巴戟天药材100 g，按上述最佳切制工艺，分别常压蒸制30 min后，切成切片长度3 mm、宽度1～2 mm，40 ℃烘干，备用。精密称取各巴戟天微型饮片2 g，置于150 mL圆底烧瓶中，分别加入80 mL氯仿，回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，回收氯仿，甲醇定容至10 mL容量瓶中，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.8.4 线性关系考察

精密吸取甲基异茜草素-1-甲醚对照品3、6、10、13、16 ?L，进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得甲基异茜草素-1-甲醚回归方程Y=7 000 000X+4 000 000，r?=0.999 9，线性范围为1.758～7.618 μg。

2.8.5 指纹图谱的建立

HPLC图谱采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件，生成指纹图谱共有模式，计算相似度。标定共有峰，以甲基异茜草素-1-甲醚为参照峰，计算共有峰的相对保留时间与相对峰面积。

2.8.6 指纹图谱相似性评价

对不同产地巴戟天微型饮片进行指纹图谱测定，结果见图4。以巴戟天传统饮片色谱图为参照谱，进行自动匹配并计算指纹图谱相似度，结果见表7。相似度均在0.90以上。

2.8.7 指纹图谱共有峰的标定

以巴戟天最佳微型饮片中甲基异茜草素-1-甲醚（保留时间34.056 min）的平均峰面积为参考峰，计算不同产地巴戟天微型饮片各共有峰的相对峰面积。

通过不同产地来源的巴戟天指纹图谱测试，共分离得到62个色谱峰，其中28个为共有色谱峰，与巴戟天传统饮片色谱图（见图5）相比，共有峰增加且其相对峰面积明显增大。进一步说明巴戟天切制成微型饮片后，有效成分煎出率有所提高。

3 讨论

本试验收集的10个不同产地巴戟天药材均来自巴戟天主要产地，经含量测定，均符合2015年版《中华人民共和国药典》巴戟天项下耐斯糖含量测定的相关规定（耐斯糖不得少于2.0%）。

切制是传统中药炮制工艺的一道重要工序，也是制备微型饮片最关键的工序[13]。为确定微型饮片的粒径及厚度范围，预试验中制备了不同粒径、大小的饮片，并对其煎出液的有效成分含量进行监测，发现粒径大小接近粉末的微型饮片在煎煮过程中极易糊锅，不易过滤，因此确定饮片长度范围为3、5、7 mm，厚度范围为1～2 mm、2～3 mm、3～4 mm。

2015年版《中华人民共和国药典》采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器对耐斯糖的含量进行测定，由于检测器的特殊性，限制其广泛应用。本试验采用超高效液相色谱-四极杆高分辨飞行时间质谱法对耐斯糖的含量进行考察，本方法更加快速、准确。

休止角是评价饮片颗粒流动性的指标，也是采用自动配方机调剂饮片时的必需参数。休止角<30°表明饮片流动性好，休止角介于30°～40°表明饮片颗粒流动性可以满足调剂基本要求，休止角>40°表明饮片流动性不好[14]。本试验制备的巴戟天微型饮片休止角均小于30°，符合饮片流动性要求，有利于实现调剂的智能化、自动化。

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（收稿日期：2018-07-03）

（修回日期：2018-07-20；编辑：陈静）