秦艽寒热不同配伍对风寒湿痹类风湿关节炎大鼠白细胞介素—6及血管内皮生长因子的影响
2019-03-29苏杉王蓉赵敏吴晨高慧琴
苏杉 王蓉 赵敏 吴晨 高慧琴
摘要:目的 观察秦艽不同配伍药对对风寒湿痹型类风湿关节炎(RA)模型大鼠白细胞介素-6(IL-6)及血管內皮生长因子(VEGF)的影响,从中药药性及复方配伍理论的角度揭示中药药性-病证-功效的关联性。方法 80只SD大鼠随机分为空白对照组、Ⅱ型胶原组、病证模型组、阳性对照组、单味秦艽组、秦威组(秦艽配伍威灵仙)、秦桑组(秦艽配伍桑寄生)、秦防组(秦艽配伍防己),每组10只。注射Ⅱ型胶原乳剂并施加风寒湿刺激制备风寒湿型RA大鼠模型。造模完成后各给药组给予相应药液,空白对照组、Ⅱ型胶原组及病证模型组给予生理盐水。实验过程中,记录大鼠一般状况;每3 d测量1次大鼠左后足跖厚度,并计算足跖肿胀度;实验第38日大鼠进行关节炎指数(AI)评分;ELISA检测大鼠血清IL-6含量;Western blot和RT-PCR分别检测大鼠踝关节VEGF的蛋白和mRNA表达。结果 与空白组比较,Ⅱ型胶原组和病证模型组足跖肿胀度、AI评分、血清IL-6含量、踝关节VEGF蛋白和mRNA表达明显增加(P<0.01);与病证模型组比较,各中药组足跖肿胀度、AI评分、血清IL-6含量、踝关节VEGF蛋白和mRNA表达均有所减少,其中秦威组最明显(P<0.01)。结论 对于风寒湿痹型RA,药性平温相配疗效优于平平相配、平寒相配及单味秦艽,实验结果与中医“疗寒以热药”的原则基本相符。
关键词:秦艽;风寒湿痹;类风湿关节炎;白细胞介素-6;血管内皮生长因子;大鼠
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2019)03-0039-06
Abstract: Objective To observe the effects of different compatibility of Gentianae Macrophyllae Radix (Qinjiao) on IL-6 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rheumatoid arthritis (RA) model rats with wind-cold-dampness arthralgia. To reveal the correlation between TCM property-syndrome-effect from the perspective of TCM properties and compound compatibility theory. Methods Totally 80 healthy SD rats were randomly divided into blank control group, collage Ⅱ model group, wind-cold-dampness syndrome model group, positive control group, single-taste Qinjiao group, Qinjiao-Weilingxian group (Qinwei group), Qinjiao-Sangjisheng group (Qinsang group), Qinjiao-Fangji Group (Qinfang group), 10 rats in each group. Rat model of wind-cold-dampness type RA was established by injecting type Ⅱ collagen emulsion and applying wind-cold-dampness stimulus. After the establishment of the model, the blank control group, collage Ⅱ model group and wind-cold-dampness syndrome model group were given normal saline, and the corresponding liquid medicine was given to each administration group. In the experiment, the general state of rats was recorded. The thickness of the left posterior metatarsal of rats was measured every 3 days, and the swelling degree of the metatarsal was calculated. The arthritis index (AI) was evaluated on the 38th day of the experiment. The content of IL-6 in serum of rats wasdetected by ELISA. Expression of VEGF in ankle joint of rats was detected by Western blot. Expression of VEGF mRNA in ankle joint was detected by RT-PCR. Results Compared with the blank group, the swelling degree, AI score, serum IL-6 content, VEGF protein expression level and VEGF mRNA expression in collage Ⅱ model group and wind-cold-dampness syndrome model group were significantly increased (P<0.01). Compared with the wind-cold-dampness syndrome model group, the foot swelling degree, AI score, serum IL-6 content, ankle VEGF protein expression level and VEGF mRNA expression of administration group were decreased, and Qinwei group was the most significant (P<0.01). Conclusion For RA of wind-cold-dampness arthralgia type, the treatment efficacy of mild and warm is better than the combined effect of mild and cold TCM or mild TCM drugs. The experimental results are basically consistent with the principle of "treating cold diseases should use hot medicine" in TCM.
Keywords: Gentianae Macrophyllae Radix; wind-cold-dampness arthralgia; rheumatoid arthritis; interleukin-6; vascular endothelial growth factorarthritis; rats
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节病变为主要症状的慢性、全身性自身免疫疾病。其临床主要表现为局部关节疼痛、肿胀、晨僵、关节软骨破坏、贫血等[1],属中医学“痹证”范畴。本研究在中医理论指导下,通过前期对秦艽不同寒热配伍的研究[2-4]及相关文献[5-8],选温性祛风湿药威灵仙、平性祛风湿药桑寄生、寒性祛风湿药防己与平性祛风湿药秦艽组成平温相配、平平相配、平寒相配的配伍关系,观察秦艽寒热不同配伍药对对风寒湿痹RA模型大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)及踝关节血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,从中药药性及复方配伍理论角度揭示中药药性-病证-功效的关联性。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠80只,雌雄皆用,体质量(200±20)g,甘肃中医药大学科研实验中心提供,动物许可证号SCXK(甘)2015-0002。饲养于温度24~26 ℃、相对湿度45%~65%环境,自由摄食饮水。
1.2 药物及制备
秦艽、威灵仙、桑寄生、防己,饮片购自兰州惠仁堂大药房,甘肃中医药大学中药鉴定教研室李成义教授鉴定均为正品。中药药液均由甘肃中医药大学中药药剂实验室协助制备。单味秦艽组:称秦艽300 g,第1次加10倍量水煎煮1 h,第2次加8倍量水煎煮30 min,合并2次药液,浓缩至每毫升含原药材1.67 g。秦艽配伍组(秦威组、秦桑组、秦防组)按1∶1比例分别取秦艽和威灵仙、秦艽和桑寄生、秦艽和防己各150 g,煎煮方法同上,药液制备完成后置于4 ℃冰箱贮存备用。雷公藤多苷片,远大医药黄石飞云制药有限公司,批号20150501,将雷公藤多苷片碾成粉末状,加适量生理盐水,配制为0.4 mg/mL雷公藤多苷混悬液,备用。
1.3 主要试剂与仪器
天然牛Ⅱ型胶原,北京Solarbio公司,批号908E052;完全弗氏佐剂,美国Sigma公司,批号SLBS1330V;冰醋酸,天津市富宇精细化工有限公司,批号20150110;IL-6试剂盒,江苏菲亚生物科技有限公司,批号MM-0190R1;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒,北京Solarbio公司,批号20170915;GAPDH Polyclonal Antibody,Immunoway Biotechnology公司,批號B5201;Anti-VEGF antibody,美国abcam公司,批号ab46154;HRP,Goat Anti-Rabbit IgG,美国Abbkine公司,批号A21020;SYBR? Green Realtime PCR Master Mix扩增试剂盒,TOYOBO公司,批号717000;ReverTra Ace? qPCR反转录试剂盒,TOYOBO公司,批号711000;GAPDH引物,生工生物工程(上海)股份有限公司,批号D829KA6434;VEGF-F,生工生物工程(上海)股份有限公司,批号1408556120;VEGF-R,生工生物工程(上海)股份有限公司,批号1408556127。改装后智能人工气候箱(气候箱中装3个风扇,控制风速为5 m/s),宁波江南仪器厂,型号RXZ-380A-LED;酶标仪,美国BIO-RAD公司,型号Benchmark Plus;电泳仪,北京六一生物科技有限公司,型号DYCZ-24DN;凝胶成像仪,美国Azure Biosystems公司,型号C300;梯度PCR仪,美国BIO-RAD公司,型号S1000TM Thermal Cycler;实时荧光定量PCR仪,美国ABI公司,型号7500。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠适应性喂养3 d,按随机数字表法将80只大鼠分为空白对照组、Ⅱ型胶原组、病证模型组(Ⅱ型胶原+风寒湿刺激)、阳性对照组、单味秦艽组、秦威组、秦桑组、秦防组,共8组,每组10只。
2.2 胶原乳剂制备
精密吸取0.3 mL冰醋酸置于50 mL容量瓶内,加入注射用水定容,得0.1 mol/L冰醋酸溶液。精密称量天然牛Ⅱ型胶原5 mg置于25 mL容量瓶内,置于冰水浴中,用配制好的冰醋酸溶液稀释、定容,得Ⅱ型胶原溶液,置于4 ℃冰箱保存过夜。注射当日,取25 mL Ⅱ型胶原溶液与等体积完全弗氏佐剂在冰水浴中充分混匀乳化,得0.1 mg/mL胶原乳剂。
2.3 造模
参考文献[3]方法,于实验第1日,除空白组外其余组大鼠在背部两点(背部脊柱两侧)及尾根部一点,剃毛,皮内注射胶原乳剂0.1 mL,共0.3 mL。第12日大鼠左后足跖皮内注射0.1 mL胶原乳剂进行二次免疫,空白组在相同部位注射等体积注射用水。从初次注射胶原乳剂第2日开始,除空白组及Ⅱ型胶原组外,其余组大鼠均采用改装后的智能人工气候箱进行风寒湿痹型RA模型的造模。风寒湿环境条件:温度4 ℃,风速5 m/s,相对湿度≥95%,风寒湿刺激时大鼠足跖没入0 ℃冰水混合液中。每日1次,30 min/次,连续18 d。
2.4 给药
造模结束后,各中药组按25 g/kg给予相应药液,阳性对照组按6 mg/kg给予雷公藤多苷混悬液,其余组给予等量生理盐水。每只大鼠给药3 mL,每日1次,连续21 d。
2.5 观察指标及方法
2.5.1 一般状况观察
实验过程中进行大鼠一般状况观察。
2.5.2 足跖肿胀度
游标卡尺测量大鼠左后足跖厚度,每3 d测量1次,计算大鼠足跖肿胀度。足跖肿胀度=(致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度)÷致炎前足跖厚度。
2.5.3 关节炎指数评分
于实验第38日起分别对大鼠进行关节炎指数(AI)评分,采用5级评分法:正常、无关节炎症计0分,足趾关节轻度发红或肿胀计1分,足趾或踝关节中度肿胀计2分,踝关节严重肿胀或踝关节以下全部肿胀计3分,整个足爪肿胀或关节严重变形、不能负重计4分。每只大鼠4只足爪评分之和作为最终的AI评分,每只大鼠最高不超过16分。
2.5.4 大鼠血清白细胞介素-6检测
大鼠末次给药1 h后,股动脉取血5 mL,静置2 h,3000 r/min离心15 min,取血清,ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-6含量,操作严格按试剂盒说明书进行。
2.5.5 Western blot检测血管内皮生长因子的蛋白表达
大鼠踝关节部位,每组3只,提取踝关节蛋白样本,并检测蛋白浓度,将样本上样至12%SDS-PAGE凝胶梳孔中,电泳,转膜,封闭,一抗VEGF(1∶899)中孵育,过夜后,洗膜,二抗孵育,洗膜,ECL发光显影,凝胶成像仪曝光,拍照,应用Image J软件检测条带光密度值,目的条带光密度值与内参条带光密度值,得目的蛋白的相对表达量。
2.5.6 RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达
取大鼠踝关节部位,每组3只,提取踝关节RNA样本。按照说明书运用Trizol法提取样本总RNA,微量紫外分光光度计检测样本RNA浓度,确保OD260/280在1.8~2.0之间,再将RNA样本采用ReverTra Ace? qPCR反转录试剂盒进行反转录,反应体系为50 μL,具体步骤按说明书进行操作。反应参数设置为:37 ℃、 15 min,98 ℃、5 min,然后-20 ℃保存。GAPDH为内参,采用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix扩增试剂盒,反应体系为20 μL,具体步骤按说明书操作。引物1 μL:VEGF上游5'-TCGGAGAGCAAC GTCACTATG-3',下游5'-TGGTCTGCATTCACATC TGC-3',产物长度40 bp。反应参数:95 ℃、60 s,95℃、15 s,60 ℃、60 s,融解曲线分析,共40个循环。
3 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件进行分析。计量资料服从正态分布时以—x±s表示,多组间数据比较用方差分析,两两比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状况
实验过程中,空白组大鼠较活跃,毛发洁白柔顺,二便正常,体质量增加快。造模组大鼠初次免疫后活动减少,毛发蓬松、色微黄,左后足跖略红肿,二便正常,體质量增加较缓慢;二次加强免疫后2 h,造模组大鼠活动明显减少,喜侧卧,左后足跖肿胀明显,行走困难,二便正常;加强免疫后第2日,左后足跖肿胀,皮肤触之柔软,呈紫红色,发热明显;加强免疫后第3日,个别大鼠左后足跖出现蜕皮现象;加强免疫后第4日,个别大鼠出现四肢肿胀;二次免疫过程中,大鼠体质量增加缓慢。治疗第2日,足跖肿胀均不同程度减小;治疗第6日,大鼠活动增加;治疗阶段,各给药组左后足跖颜色由紫红色变深红色至淡红色,多数最后恢复为肤色,体质量增加稍快,行走较自如。Ⅱ型胶原组及病证模型组未见明显恢复。
4.2 秦艽不同配伍药对对大鼠足跖肿胀度的影响
实验第18日,与空白组比较,造模组大鼠足跖肿胀度明显升高(P<0.01);实验第36日,与病证模型组比较,各给药组大鼠足跖肿胀度均明显降低(P<0.05,P<0.01),其中秦威组最明显,且秦威组肿胀度明显低于秦防组(P<0.05)。结果见表1。
4.3 秦艽不同配伍药对对大鼠关节炎指数评分的影响
与空白组比较,Ⅱ型胶原组和病证模型组大鼠AI评分显著升高(P<0.01),且病证模型组AI评分明显高于Ⅱ型胶原组(P<0.01);与Ⅱ型胶原组及病证模型组比较,各给药组大鼠AI评分明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);各中药给药组间比较,秦威组大鼠AI评分明显低于秦防组(P<0.05)。结果见表1。
4.4 秦艽不同配伍药对对大鼠血清白细胞介素-6含量的影响
与空白组比较,Ⅱ型胶原组及病证模型组大鼠血清IL-6含量明显升高(P<0.01);与Ⅱ型胶原组比较,阳性对照组、单味秦艽组、秦威组大鼠血清IL-6含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与病证模型组比较,各给药组大鼠血清IL-6含量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),其中秦威组血清IL-6含量最低。结果见表2。
4.5 秦艽不同配伍药对对大鼠踝关节血管内皮生长因子蛋白表达的影响
与空白组比较,Ⅱ型胶原组与病证模型组大鼠VEGF蛋白表达明显升高(P<0.01),且病证模型组高于Ⅱ型胶原组(P<0.05);与Ⅱ型胶原组比较,阳性对照组、秦威组、秦防组大鼠VEGF蛋白表达均明显降低(P<0.01);与病证模型组比较,阳性对照组、秦威组、秦桑组和秦防组大鼠VEGF蛋白表达均明显降低(P<0.01);各给药组间比较,阳性对照组、秦威组及秦防组大鼠VEGF蛋白表达明显低于单味秦艽组及秦桑组(P<0.05,P<0.01)。结果见表3、图1。
4.6 秦艽不同配伍药对对大鼠踝关节血管内皮生长因子mRNA表达的影响
与空白组比较,Ⅱ型胶原组与病证模型组大鼠VEGF mRNA表达明显升高(P<0.01);与Ⅱ型胶原组及病证模型组比较,阳性对照组、单味秦艽组、秦威组、秦桑组大鼠VEGF mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01);各给药组间比较,单味秦艽组大鼠VEGF mRNA表达明显高于阳性对照组(P<0.01);秦威组大鼠VEGF mRNA表达明显高于阳性对照组(P<0.01),而低于单味秦艽组(P<0.01);秦桑组大鼠VEGF mRNA表达明显高于阳性对照组、单味秦艽组及秦威组(P<0.01);秦防组大鼠VEGF mRNA表达明显高于阳性对照组、单味秦艽组、秦威组及秦桑组(P<0.01)。见表4。
5 讨论
RA不仅侵犯关节滑膜、软骨、韧带和肌肉,还可能影响心、肺等脏器功能[9]。IL-6是一种具有多种生物活性的细胞因子,主要由巨噬细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、成骨细胞、肿瘤细胞等分泌产生[10-11],可介导炎症反应和免疫反应等[12],在许多炎性疾病中表达量高,如RA、系统性红斑狼疮等[13-14]。IL-6不仅参与关节破坏和炎症发生,还可参与RA多系统损害,RA患者出现关节滑膜、软骨破坏的局部症状及贫血、疲劳、低热等全身症状均与IL-6相关,且全身症状的周期性和IL-6周期性相关。IL-6及IL-6受体(IL-6R)水平与RA患者的类风湿因子(RF)、红细胞沉降率、C反应蛋白(CRP)及临床表现相关[12]。因此抑制IL-6及IL-6R水平能够改善RA患者的关节症状,控制病情的发展。IL-6可提高VEGF的水平,促进炎性细胞渗出,提高关节血管通透性,加重关节炎症及血管翳的形成,血管翳具有类似于肿瘤组织侵蚀的作用,可引起关节软骨破坏,对RA的发生及发展起重要作用[15-16]。VEGF是RA血管新生的重要因子,主要由成纤维细胞及中性粒细胞等分泌[17]。研究显示,VEGF在RA患者关节滑膜处高表达,随着病情发展,VEGF含量升高,且与RF含量、红细胞沉降率及CRP等呈正相关,可作为诊断RA患者关节损害和预后的重要指标[18]。VEGF抑制剂对于血管新生有特异性的抑制作用,可明显改善RA病情[19]。
本实验结果显示,与空白组比较,Ⅱ型胶原组及病证模型组足跖肿胀度、AI评分、IL-6含量、踝关节VEGF蛋白相对表达量及踝关节VEGF mRNA相对表达量明显升高(P<0.01),且病证模型组高于Ⅱ型胶原组,提示Ⅱ型胶原诱导加风寒湿刺激模型比单纯Ⅱ型胶原模型病情严重,造模基本成功。经药物治疗后,各给药组足跖肿胀度、AI评分、IL-6含量、踝关节VEGF蛋白及mRNA表达均有不同程度降低,其中秦威组及阳性对照组降低最明显,优于单味秦艽组、秦桑组及秦防组。
综上所述,药性平温相配的秦威组改善风寒湿痹RA的效果优于平平相配的秦桑组、平寒相配的秦防组及平性单味秦艽组,其机制可能与其降低血清IL-6含量及踝关节VEGF表达水平,减轻关节软骨破坏及血管翳形成有关。提示对于寒性病证,应给予热性药物治疗会取得更好的治疗效果,与中医“疗寒以热药”治疗原则相符。
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(收稿日期:2018-06-29)
(修回日期:2018-07-31;编辑:华强)