化疗所致老年弥漫大B细胞淋巴瘤患者细胞遗传学损伤的研究

刘 炜， 李 迅， 蒋 艳， 杨顺娥

(1新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺内科， 乌鲁木齐 830011； 2乌鲁木齐市疾病控制中心， 乌鲁木齐 830002)

随着我国人口老龄化，老年人淋巴瘤的发病率逐年增高。化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也造成损害。老年人相对年轻患者同时患有糖尿病、高血压、心脏病等合并症较多，因此化疗后毒性反应重，化疗耐受程度差。这是影响化疗剂量强度、化疗周期、疗效和预后的重要原因。为减轻化疗不良反应，预防和减少化疗药物对机体造成的损害，近年来，国内外学者进行了大量的研究，尤其是在细胞遗传学方面的研究，希望通过合适的方法找到特异性或敏感性较强的预测因子和监测指标，以预防或减轻化疗药物所致的细胞毒性。而血液学毒性是临床上最常见的化疗毒性反应之一。姐妹染色单体交换试验、多核细胞法次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因突变试验、胞质分裂阻滞法微核试验对检测DNA损伤有较高的敏感性。因此本研究通过检测化疗前后外周血淋巴细胞姐妹染色单体交换 (sister chromatid exchanges, SCE)率、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT) 基因突变率、微核(micronucleus, MN) 率以及白细胞(white blood cell, WBC)变化程度，旨在探讨SCE率、HPRT基因突变率、MN率作为细胞遗传学损伤的生物标记物对化疗所致老年弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse Large B-cell lymphoma，DLBCL)患者遗传学损伤的评估和预测意义。

1 实验资料及方法

1.1一般资料选取2016年11月-2018年6月新疆医科大学附属肿瘤医院住院化疗的初治老年弥漫大B细胞淋巴瘤患者共87例，年龄在60岁～80岁之间，平均年龄(67.3±5.4)岁，男性49例，占56.3%，女性38例，占43.7%。纳入标准：(1)术后病理组织学证实的临床分期为 Ⅰ～Ⅲ期弥漫大B细胞淋巴瘤初治病例。(2)非霍奇淋巴瘤患者美国东部协作组(Eastern cooperative Oncology Group, ECOG)评分≥2分。(3)无其他合并症，无毒物、放射线接触史。(4)年龄>60岁。(5)长久居住于新疆地区不少于30年。排除标准：(1)年龄<60岁，或年龄>80岁。(2)既往接受过化疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者。(3)吸烟患者。

1.2实验方法

1.2.1 血标本收集 使用EDTA管分别采集2 mL患者化疗前及结束后24 h内的外周静脉血，置于4℃冰箱保存，采血后5h内对其接种培养。因化疗毒副反应严重而减少药物剂量的患者也计算在内，减量不超过15%。患者每疗程化疗前后检测血常规。

1.2.2 化疗方案 为RCHOP方案，即利妥昔单抗375 mg/m2，第0天，静点；环磷酰胺750 mg/m2，第1天，静脉推注；吡柔比星50 mg/m2，第1天，静脉推注；长春新碱1.4 mg/m2(最大剂量 2 mg)，第1天静脉推注；第1至第5天口服醋酸泼尼松片100 mg/m2，21 d为1个周期，监测4个周期。

1.2.3 姐妹染色单体交换试验(sister chromatid exchange assay,SCE assay) 阅片, 油镜下(×1 000倍)选择染色体展开好,染色好的含有2个染色体组的细胞,观察有丝分裂第二周期中期相SCE计数。在染色单体两端出现的交换及着丝点部位出现的交换分别记为1次SCE,在染色单体中间出现的交换记为2次SCE，计算平均SCE次数，以百分率(%)表示。

1.2.4 微核试验(cytokinesis block micronucleus assay,CB-MN assay) 采用胞质分裂阻滞法，高倍镜下(×400倍)阅片:观察含有双核的淋巴细胞，每个双核淋巴细胞内所含微核数不超过6个，微核直径是主核的1/16～1/3，且与主核分离独立，须有独立的核膜。计数每高倍视野下1 000个双核淋巴细胞中微核的发生率(MNf),以千分率(‰)表示。

1.2.5 HPRT基因位点突变试验(multi cyto hprt gene locus mutant assay, HPRT mutant assay) 采用多核细胞法，阅片:含有≥2个以上核的淋巴细胞为突变细胞。计数每1 000个转化细胞中6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine, 6-TG)所致突变的细胞/不含6-TG的每1 000个转化细胞为HPRT基因突变率(‰)。

2 结果

2.1显微镜下结果观察到镜下发生姐妹染色单体交换的染色体如图1；多核法测得的含有多个核的转化淋巴细胞如图2；胞质分裂阻滞法测得的微核淋巴细胞如图3。

图1有丝分裂第二周期中期相SCE为4次(×1000倍)

图2含有多个核的转化淋巴细胞(×1000倍)

图3含有1个微核的双核淋巴细胞(×400倍)

2.21～4周期老年DLBCL患者SCE率、HPRT基因突变率、MN率的变化比较

2.2.1 SCE率变化的比较 每个周期化疗后，SCE率均较化疗前增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，如表1；各周期化疗后的SCE率呈现升高趋势，第2、第3、第4周期化疗后SCE率较第1周期明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；第4周期化疗后SCE率较第2周期明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图4。

2.2.2 HPRT基因突变率变化的比较 每个周期化疗后的HPRT基因突变率均较化疗前增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，如表2； 1～4周期各周期化疗后的HPRT基因突变率差异无统计学意义(P>0.05)，如图5。

指标第1周期第2周期第3周期第4周期治疗前20.0(15.0,26.0)40.0(30.0,50.0)50.0(35.0,59.0)50.0(40.0,65.0)治疗后39.0(25.0,60.0)55.0(40.0,69.0)60.0(45.0,80.0)60.0(50.0,88.0)Z-7.529-7.345-7.400-7.343P<0.001<0.001<0.001<0.001

表2 老年DLBCL患者4个周期化疗前后HPRT基因突变率变换情况比较[‰， M(P25,P75)]

2.2.3 MN率变化的比较 各周期化疗后的MN率均较治疗前增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，如表3；各周期化疗后的MN率呈现升高趋势，第2、第3、第4周期化疗后MN率较第1周期明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；第4周期化疗后MN率较第2周期明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图6。

2.3SCE率、HPRT基因突变率、MN率与各周期化疗后平均白细胞变化程度的相关性1～4周期化疗后SCE率的升高程度、MN率的升高程度与WBC下降程度均呈负相关(P<0.001)，HPRT基因突变率的升高程度与WBC计数下降程度呈正相关(P<0.001)，如图7～9。

表3 老年DLBCL患者4个周期化疗前后MN率变换情况比较[%， M(P25,P75)]

图7化疗前、后SCE率的变化与WBC变化相关性散点图

图8化疗前、后HPRT基因突变率的变化与WBC变化相关性散点图

图9化疗前、后MN率的变化与WBC变化相关性散点图

3 讨论

SCE是指1条染色体的2条染色单体之间同源片段的交换。它不仅从细胞水平上阐述染色体结构的变化, 而且从分子水平显示DNA损伤、修复和重组的情况[1]。MN是在辐射或某些化学诱变剂作用下导致的染色体发生断裂后，细胞进入下一次分裂时，染色体断片不能随有丝分裂进入子细胞核，在胞浆中形成完全与主核分开的大小不等的圆形或椭圆形微小核(直径<1/3主核)[2]。HPRT基因位于X 性染色体长臂远端Xq26 区域上，它编码的表达产物HPRT 是一种细胞膜酶，参与细胞体内嘌呤核苷酸合成的补救途径，如缺乏或活性降低会引起核酸代谢异常[3]。SCE试验、HPRT基因突变试验及MN试验均可敏感地检测出细胞遗传学损伤，在化学诱变、环境监测、肿瘤研究方面应用广泛[4-11]。

本研究结果显示，4个化疗周期过程中，每个周期化疗后SCE率比相应的各周期化疗前显著升高(P<0.001)，这与Medves等[12]、Suspiro等[13]的研究结果一直；HPRT基因突变率、MN率也在化疗后显著升高，这与Elsendoom等[14]的研究一致。再次证实了SCE率、HPRT基因突变率、MN率能很好地体现化疗所导致的细胞遗传学损伤程度。本研究结果表明，随着化疗周期的增多、化疗药物剂量的累加，SCE率、MN率也逐渐增高，呈明显上升趋势(如图4、6所示)，提示SCE率、MN率敏感性较高。而HPRT基因突变率并未随着化疗周期的增加、化疗药物剂量的累积而相应地呈现逐渐升高趋势(如图5所示)，这与齐广涛等[15]的研究结果一致。提示HPRT基因突变率灵敏度较差，而Elsendoom等[14]认为HPRT基因突变率未能随化疗药物的累积呈升高趋势，可能是由于细胞对突变表达滞后，导致HPRT可能在化疗结束后很久，也可能是几个月以后才能明显升高。而本研究的检测时间点可能早于HPRT基因突变的升高点,并且没有继续再做后续的动态跟踪监测；也可能与样本量较少、实验条件的限制有关。

老年DLBCL患者SCE率、HPRT基因突变率、MN率的升高均与平均白细胞下降之间存在相关性(如图7～9所示)，这与安菊生等[16]的研究结果一致。随着化疗周期增多，药物剂量累积，毒性蓄积，细胞遗传学损伤也相应加重，表现为SCE率、HPRT基因突变率、MN率的相应升高。而毒性的蓄积，临床上则表现为患者骨髓抑制程度逐渐加重，白细胞下降越低表明毒性越重，而细胞遗传学损伤也越严重。因此，本研究体现了化疗所致的细胞遗传学损伤程度与临床血液学毒性程度具有一致性。骨髓抑制尤其是白细胞的降低，通常在化疗后第7～14天最严重，而本研究是在化疗后24 h进行检测，因此以上三项指标对化疗后的骨髓毒性的严重性具有一定的预测意义，即SCE率、HPRT基因突变率、MN率升高越高，提示可能出现的骨髓抑制也越严重，此研究结果可为筛选那些可能发生严重骨髓抑制的老年患者提供参考，从而为可能发生严重骨髓抑制的老年患者制定相应的个体化的预防措施，避免严重骨髓抑制的出现或减轻骨髓抑制所带来的并发症，确保化疗按时进行，确保足够的剂量强度，以改善患者预后、延长生存时间。不仅如此，Salawu等[1]发现在软组织肉瘤中，SCE率与放疗剂量具有显著相关性，提示SCE率在恶性肿瘤放疗所造成的损伤方面也具有一定的评估价值，但是否能作为一种生物标记物还有待进一步的论证。

综上所述，SCE率、HPRT基因突变率、MN率能够较好地反映老年DLBCL患者化疗所致的细胞遗传学损伤程度，并与骨髓抑制的严重程度具有相关性和一致性，因此在临床中具有一定的评估价值和预测意义。但是，作为预测因子，能够体现Ⅳ度骨髓抑制的阈值还有待进一步的研究和重复的试验来确定和论证。参考国内外相关文献，有关以上三项指标得出的结论并不完全一致，这与实验方法、实验试剂配置、实验环境等实验条件不同有关，还与样本含量不足有关，所以还需要建立统一的、标准的实验方式，同时扩大样本含量来获得更为可靠的结论。