三种猕猴桃酒发酵过程中挥发性香气成分的变化

,,王文

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch)为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)藤本植物的肉质果实,俗称阳桃、羊桃、藤梨、猕猴梨等,主要分布于我国的四川省、湖北省、湖南省以及陕西省一带[1]。按最新分类方法,目前猕猴桃属有54个种和21个变种,其中分布于我国的种有52个,可见我国猕猴桃种质资源极为丰富[2]。我国种植的猕猴桃品种按照成熟果实的果肉颜色类型来看,绿肉品种居多,占总产量的75.3%,黄肉品种和红心品种偏少,分别占7.7%和8.1%[3]。祝以伟等[4]和郭秀兰等[5]对黄肉、红心和绿肉三种猕猴桃的基本营养成分进行了分析与比较,三种猕猴桃的基本成分存在明显差异。

猕猴桃属于典型的呼吸跃变型果实,采后极易腐烂,除鲜销之外,充分开发利用猕猴桃资源对提高猕猴桃经济价值有着重要的现实意义[6]。采用酿造果酒的方法对猕猴桃进行深度加工制作猕猴桃果酒,是近年来猕猴桃相关产品开发的主要方向[7-8]。香气是评价猕猴桃果实及其果酒内在品质的重要指标,香气的风格和特点影响着猕猴桃果酒的风味品质和消费者的选购心理。Soufleros等[9]对产自希腊的猕猴桃发酵酒的糖、酸、酒精度和挥发性风味成分等进行了定量分析和感官评价。Li等[10]采用主成分分析法分析挥发性风味成分,能将六种商业化酵母菌株发酵的猕猴桃酒的风味特征较好地区分开。陈亮等[11]对普通猕猴桃、红心猕猴桃和野生软枣猕猴桃发酵酒的香气成分进行了鉴定与分析,得出了每种猕猴桃酒的主要香气成分。目前,关于不同品种猕猴桃发酵酒的香气成分差异的报道较少,猕猴桃酒在发酵过程中香气成分的变化规律更未见报道。

“金艳”猕猴桃是全球三大优良黄肉猕猴桃品种之一,是1984年由中国科学院武汉植物园利用中华猕猴桃和毛华猕猴桃进行种间杂交选育而成,果肉金黄色、细嫩多汁、香甜可口[12]。“红阳”猕猴桃是四川省“八五”育种攻关期间从四川苍溪县野生红心猕猴桃中选育出的世界首个红心型新品种,果心横截面呈放射状红色条纹形似太阳,色彩鲜美,果汁丰富,酸甜适中,清香爽口[13]。“米良1号”猕猴桃是湖南吉首大学在湘西米良乡美味猕猴桃中选育出来的优良绿肉品种,汁多、甜酸适度、肉质鲜嫩、具有清香味[14]。本研究以金艳、红阳和米良1号三种分别代表黄肉、红心和绿肉类型的猕猴桃为原料,在相同发酵工艺条件下,采用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用技术测定前发酵结束时、后发酵中期和后发酵结束时三种猕猴桃酒的挥发性香气成分,为研究不同猕猴桃果实品种对发酵酒风味品质的影响以及探明猕猴桃酒风味品质形成规律提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金艳猕猴桃(黄肉)、红阳猕猴桃(红心) 取自四川省蒲江县;米良一号猕猴桃(绿肉) 取自湖北省宜昌市。猕猴桃果实约八九成熟,初始糖度分别为红阳猕猴桃16 °Brix左右,金艳猕猴桃13 °Brix左右,米良一号猕猴桃11 °Brix左右,初始酸度分别为红阳猕猴桃10～11 g/L,金艳猕猴桃10～11 g/L,米良一号猕猴桃12～13 g/L(果汁酸度以柠檬酸计);安琪葡萄酒、果酒专用酵母SY 购自湖北省安琪酵母股份有限公司;偏重亚硫酸钾、果胶酶 烟台曼森公司;白砂糖 市售;环己酮(GC级) 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂 均为分析纯。

JS30-230多功能搅拌机 苏泊尔股份有限公司;隔水式电热恒温培养箱 宁波市机电工业研究设计院;PL-303电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Thermos气相色谱质谱联用仪,配置Triplus进样系统,具备顶空固相微萃取方式 美国Thermos公司。

1.2 实验方法

1.2.1 猕猴桃酒发酵工艺流程

操作要点:挑选八、九成熟的猕猴桃果实,洗净后去皮打浆,以80 mg/L SO2量计添加偏重亚硫酸钾。按40 mg/L向果浆中添加果胶酶,在40 ℃水浴中酶解2 h,然后用4层纱布过滤,得到猕猴桃浊汁,果汁pH为3.2～3.7,添加白砂糖调整初始糖度至22 °Brix。按照0.4 g/L的接种量加入活性干酵母,28 ℃下进行前发酵5 d,当还原糖含量降至12 g/L以下,去渣分离,得到原酒。原酒在18 ℃下进行后发酵14 d,还原糖含量降至4.0 g/L以下结束发酵。

1.2.2 猕猴桃酒香气成分的测定

1.2.2.1 猕猴桃酒香气成分的提取 取5 mL样品置于20 mL样品瓶中,加入1.0 g NaCl促进挥发性成分的挥发,加入3 μL环己酮,加盖密封,采用老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插进样品瓶,在60 ℃条件下,预孵化10 min,萃取30 min后拔出,将萃取针插入气相色谱仪进样口,于230 ℃解析2 min。

1.2.2.2 GC-MS条件 气相色谱条件:HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流模式,不分流1 min之后分流比为50∶1;流速1 mL/min;升温程序:40 ℃保持3 min,以6 ℃/min升温至180 ℃并保持2 min,再以10 ℃/min升温至230 ℃并保持6 min;载气为99.999%氦气;进样口温度230 ℃;解析时间2 min。

质谱条件:电离方式为电子电离源,电子能量70 eV,离子源温度250 ℃,传输线温度280 ℃,采集模式为全扫描模式,质量扫描范围33～350 amu。

1.2.2.3 香气成分的定性定量分析 运用NIST数据库对结果进行初步检索及资料分析,再结合人工谱图解析,定性确定各种组分。定量采用内标法进行半定量分析,以环己酮作为内标物[15]。计算公式为:

各香气成分的含量(μL/L)=(各组分的峰面积×内标物体积(μL))/内标物峰面积×样品量(L)

1.3 数据处理

用SPSS 18.0进行差异显著性分析。组内比较采用单因素方差分析,组间差异性分析采用Duncan法,以p<0.05为差异具有统计意义标准。

2 结果与分析

2.1 三种猕猴桃发酵酒挥发性香气成分的测定结果

从表1可以看出,三种猕猴桃发酵原汁仅检测出低含量的乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲酸甲酯,金艳发酵原汁多检出了己酸乙酯和辛酸乙酯。发酵过程中猕猴桃酒的24种主要香气组分包括17种酯类、5种醇类和2种酸类物质,三种猕猴桃酒之间香气种类差别很小,但含量存在明显差异。发酵5 d时,三个品种的乙醇含量显著(p<0.05)增加,还新产生了异丁醇、异戊醇和苯乙醇。红阳产生的异丁醇和异戊醇含量高,米良一号产生的异戊醇和苯乙醇含量高,相比之下金艳产生的异丁醇、异戊醇和苯乙醇含量偏低。经过5 d的前发酵过程,红阳和金艳的丁酸乙酯、金艳的己酸乙酯相比原汁没有显著变化(p>0.05),红阳和米良一号的苯甲酸甲酯显著低于发酵原汁(p<0.05)以外,红阳产生了13种新的酯类物质,金艳产生了12种新的酯类物质,米良一号产生了13种新的酯类物质,并且金艳产生的各种酯类物质含量都显著高于红阳和米良一号(p<0.05)。三个品种新产生了辛酸,米良一号还多产生了癸酸。表明在前发酵5 d过程中,在酵母菌的发酵作用下,发酵原汁中的风味前体物质转化成了各种丰富的挥发性香气成分。

表1 三种猕猴桃发酵酒中挥发性香气组分的GC-MS分析结果(μL/L)Table 1 Results of volatile aroma components from three kiwifruit wines by GC-MS(μL/L)

续表

续表

发酵12 d时,三个品种的乙醇、异丁醇和异戊醇含量都有降低,除米良一号的苯乙醇几乎没有变化以外,金艳和红阳的苯乙醇含量也有降低。酯类物质中除红阳的辛酸乙酯和癸酸乙酯以及米良一号的癸酸乙酯含量有一定增加以外,其他酯类物质的含量都有所降低或变化不明显,金艳产生的各种酯类物质含量仍显著高于红阳和米良一号(p<0.05)。三个品种的辛酸和癸酸含量也有下降。表明在后发酵过程中(发酵第5～12 d),各种挥发性成分含量呈现降低趋势,相比前发酵刚结束时(发酵第5 d)总体的香气减弱。

发酵19 d时,三个品种的乙醇含量回升至发酵5 d时的水平,金艳的苯乙醇和红阳的壬酸乙酯含量有显著增加(p<0.05),其他的醇类、酯类和酸类物质均进一步降低或变化不明显,说明在后发酵过程中(发酵第12～19 d),总体的香气继续减弱并逐渐趋于稳定。

2.2 三种猕猴桃发酵酒香气成分的主成分分析

由表2可以看出,以猕猴桃果酒的24种香气组分作为变量进行主成分分析,根据特征根大于1的原则提取了4个主成分因子,包含了原始变量91.243%的信息。从主成分因子载荷矩阵表3中可以看出,24个变量在4个主成分上的载荷系数大小,即其对主成分的贡献率大小。主成分因子1反映15个酯类(除棕榈酸乙酯和壬酸乙酯以外的其余酯类)和辛酸的信息,主成分因子2反映苯乙醇、异丙醇、棕榈酸乙酯和癸酸的信息,主成分因子3反映了异丁醇和异戊醇的信息,主成分因子4则体现了乙醇和壬酸乙酯的信息。

表3 主成分因子载荷矩阵Table 3 Principal component factor load matrix

表2 总方差解释Table 2 Total variance explanation

如表4所示,第一主成分包括绝大部分酯类物质,乙酸乙酯呈甜果香,乙酸异戊酯有香蕉香,辛酸乙酯有菠萝、梨和花香,癸酸乙酯具有水果香气,月桂酸乙酯具有花香和果香气味,己酸乙酯具有青苹果香和花香,丁酸乙酯具有草莓、香蕉香,辛酸异戊酯有水果香味,乙酸苯乙酯具有令人愉悦的茉莉花香[16-17],因此第一主成分可以体现猕猴桃酒的花香和果香气息。在整个发酵过程中,红阳猕猴桃酒在发酵5 d(301.29 μL/L)和12 d(301.58 μL/L)时第一主成分含量都很高且相近,发酵19 d(192.06 μL/L)时第一主成分含量大幅下降;同样,米良一号猕猴酒在发酵5 d(210.77 μL/L)和12 d(231.52 μL/L)时第一主成分含量均较高,发酵19 d(142.68 μL/L)时第一主成分含量明显下降;金艳猕猴桃酒伴随发酵进程第一主成分含量不断降低。可见,红阳和米良一号猕猴桃酒的果香和花香形成于发酵12 d内,在进一步的后发酵期中果香和花香明显减弱;金艳猕猴桃酒的果香和花香则形成于发酵5 d内,在后发酵期内果香和花香递减。并且,在整个发酵过程中酯类物质总含量为金艳猕猴桃酒>红阳猕猴桃酒>米良一号猕猴桃酒。

表4 三种猕猴桃酒发酵过程中主成分含量变化(μL/L)Table 4 The variation of principal component contents from three cultivars of kiwifruit wines during fermentation process(μL/L)

在第二主成分的四个组分中苯乙醇和癸酸是主要贡献组分。苯乙醇赋予猕猴桃酒玫瑰花香,在整个发酵过程中,米良一号猕猴桃酒的苯乙醇含量明显高于红阳和金艳猕猴桃酒,具有更为突出的玫瑰花香;红阳、金艳和米良一号猕猴桃酒的苯乙醇含量分别在发酵5、19、12 d时达到最高。三种猕猴桃果酒中只有米良一号猕猴桃酒检测出癸酸,高级脂肪酸一般具有脂肪、奶酪味道,对酒有腐臭、刺激的负向贡献。第三主成分包括异丁醇和异戊醇两组分,体现了猕猴桃酒的高级醇含量。三种猕猴桃酒的第三主成分含量都是在发酵5 d时达到最高值,发酵12 d时含量大幅降低,发酵19 d时含量变化不明显。表明三种猕猴桃酒的高级醇都是在前发酵过程中产生,前发酵结束时含量升至最高,后发酵过程中含量不断降低并趋于稳定。并且,在整个发酵过程中,红阳和米良一号猕猴桃酒的高级醇含量高于金艳猕猴桃酒。第四主成分中乙醇是主要贡献组分,其构成猕猴桃酒的酒香。三种猕猴桃酒在发酵过程中乙醇含量变化呈现相同趋势,发酵5 d时乙醇含量达到较高水平,发酵12 d时乙醇含量有小幅降低,发酵19 d时乙醇含量回升至发酵5 d时的水平。

3 讨论与结论

高级醇又称杂醇油,是酵母菌酒精发酵的正常副产物,主要由正丙醇、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、活性戊醇(2-甲基-1-丁醇)和异戊醇(3-甲基-1-丁醇)组成。适量的高级醇促使酒类具有丰满的香气和口味,增加酒的协调性,赋予酒醇厚感。但含量过高时将会使酒产生异味,如苦味、汗臭味和腐败味等,严重影响酒的质量与风味[18]。本研究从三种猕猴桃发酵酒中仅检出异丁醇和异戊醇,据报道这两种醇也正是酒中主要的高级醇,用这两种醇足以评价高级醇对酒风味的影响[19]。魏运平[20]报道,采用不同品种的猕猴桃进行发酵产生的高级醇含量差别明显。本研究结果得出,在发酵第5、12、19 d时,红阳和米良一号猕猴桃酒的高级醇含量均高于金艳猕猴桃酒,红阳和米良一号猕猴桃酒之间也存在一定差异。魏运平和本研究结果说明猕猴桃品种对猕猴桃酒的高级醇含量有直接影响。

李华等[21]、刘树文等[22]和郭静等[23]都对猕猴酒的挥发性香气成分进行了定性鉴定与分析,Soufleros等[9]还对希腊猕猴酒的香气成分进行了研究。本研究对发酵结束后的猕猴桃酒香气成分进行分析,运用内标法对醇类、酯类和酸类24个香气成分进行相对定量分析,得出的主要香气成分与李华、刘树文、郭静和Soufleros等报道的物质有相同之处,都检出了异丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯等重要挥发性香气成分。然而,李华、刘树文、Soufleros和本研究都从猕猴桃酒中检出相对含量较高的异戊醇,而郭静等没有检出异戊醇而检出活性戊醇;本研究检出相对含量较高的辛酸和癸酸与郭静等报道一致,没有检出李华和刘树文等报道的己酸,也没有检出Soufleros报道的丁酸和异丁酸。郭静和本研究采用了顶空固相微萃取法,郭静使用非极性PDMS萃取头,本研究使用的是中等极性DVB/CAR/PDMS萃取头,李华和刘树文等采用了溶剂萃取法,Soufleros采用的是直接进样法。可见,不同的香气成分提取方式可能是造成检出物质差异的原因之一。

本文对三个品种猕猴桃在酵母菌发酵过程中形成的香气成分进行了相对定量分析,检出24种主要的香气成分,发现前发酵后金艳猕猴桃酒的酯类物质含量显著高于红阳和米良一号猕猴桃酒,后发酵过程中酯类物质含量有所降低但金艳猕猴桃酒的酯类含量仍高于红阳和米良一号猕猴桃酒,表现为发酵过程中金艳猕猴桃酒的乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯等含量均明显高于红阳和米良一号猕猴桃酒。在整个发酵过程中米良一号猕猴桃酒的苯乙醇含量明显高于其他两种,具有更为突出的玫瑰花香;红阳、金艳和米良一号猕猴桃酒的苯乙醇含量分别在发酵5、19、12 d时达到最高。米良一号和红阳猕猴桃酒的高级醇含量明显高于金艳猕猴桃酒,米良一号和金艳猕猴桃酒的乙醇含量略高于红阳猕猴桃酒,醇类物质含量均在前发酵结束时升至最高,后发酵阶段醇类物质含量逐渐降低并趋于稳定。