响应面法优化马鞭草中总黄酮闪式提取工艺及其体外抗氧化活性

(南阳医学高等专科学校,河南南阳 473061)

马鞭草(VerbenaofficinalisL.)为马鞭草科植物马鞭草的干燥地上部分,马鞭草作为传统中药,收录于《中国药典》之中,具有活血散瘀、解毒、利水消肿、退黄、截疟等功效[1-2],在临床上广泛用于治疗白喉、疟疾等症状。《中国药典》2015版将马鞭草中齐墩果酸和熊果酸作为马鞭草质量控制的主要指标,但是马鞭草中还存在多种化学成分如:黄酮类、挥发油类、环烯醚萜类、糖类等[3-4]。这些化学成分也具有显著的活性作用,故亟需对其理化性质及生物活性进行研究分析。其中黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,具有抗炎、抗病毒、强心、镇静、镇痛、抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等作用[5-8]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马鞭草 购于河南省药材公司,并经鉴定为VerbenaOfficinalisL.全草;芦丁 上海晶纯实业有限公司,纯度>99%;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH· Sigma);邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢、抗坏血酸、无水乙醇、甲醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝 均为国产分析纯,使用前未进一步纯化,水为蒸馏水。

JHBE-50S闪式提取器 河南金鼎科技有限公司;Lab Tech UV-BlueStra紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司;BS210S电子分析天平 北京赛多利斯公司;DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;RE52CS旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;TDL-5-A台式离心机 上海安亭科学仪器厂;KQ-50E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 以芦丁为对照品,精密称取105 ℃下干燥至恒重的芦丁0.0200 g,用少量70%的乙醇溶解,定容于100 mL容量瓶中,摇匀,其质量浓度为0.2000 g·L-1。分别移取芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、0.4、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL比色管中,加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,摇匀,静置6 min,再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,充分摇匀,静置6 min。再加入4%的NaOH溶液4 mL,混匀后用70%的乙醇定容至刻度,摇匀并放置15 min,以试剂空白为对照,用1×1 cm的比色皿在507 nm处测定吸光度[19]。以芦丁浓度C为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为:y=11.53x-0.0059,R2=0.9989。表明芦丁对照品溶液在10.00～60.00 μg/mL范围内浓度和吸光度线性关系良好。

1.2.2 马鞭草中总黄酮的提取及含量的测定 闪式提取马鞭草中总黄酮的工艺流程:将自然风干至恒重的马鞭草粉碎后过60目筛,准确称取2.00 g置于250 mL闪式提取器中进行闪式提取,提取液经离心后抽滤,将滤液经减压浓缩至无醇味后用70%的乙醇溶液，定容至250 mL容量瓶中。

总黄酮含量的测定:采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH[19]分光光度法。准确量取样品溶液2 mL于10 mL比色管中,按照“1.2.1”中所述方法进行操作,以试剂空白为对照,用1×1 cm的比色皿在507 nm处测定吸光度,计算马鞭草中总黄酮的含量。

总黄酮含量(mg/g)=提取的总黄酮质量(mg)/原料质量(g)

1.2.3 闪式提取马鞭草中总黄酮的单因素实验 以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数四个因素为研究对象,以马鞭草中总黄酮含量为指标进行单因素实验。

1.2.3.1 乙醇浓度的选择 准确称取6份已粉碎的马鞭草样品各2.00 g置于250 mL闪式提取器中,在固定料液比1∶30 g/mL、闪式提取时间为2 min、提取1次的条件下进行闪式提取。考察不同乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)对总黄酮含量的影响。

1.2.3.2 料液比的选择 准确称取6份粉碎的马鞭草样品各2.00 g置于250 mL闪式提取器中,在固定乙醇浓度60%、提取时间为2 min、提取1次的条件下,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50 g/mL)对总黄酮含量的影响。

1.2.3.3 提取时间的选择 准确称取6份粉碎的马鞭草样品各2.00 g置于250 mL闪式提取器中,固定料液比为1∶35 g/mL、乙醇浓度为60%、提取1次的条件下,考察提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min)对总黄酮含量的影响。

1.2.3.4 提取次数的选择 准确称取5份粉碎的枣果皮样品各2.00 g置于250 mL闪式提取器中,固定料液比为1∶35 g/mL、乙醇浓度为70%、提取时间为2 min,考察提取次数(1、2、3、4、5次)对总黄酮含量的影响。

1.2.4 响应面优化试验 采用Box-Behnken的中心组合原理为依据,以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为自变量,总黄酮的含量为因变量,采用4因素3水平响应面优化提取工艺,利用统计学分析软件Design Expert 8.0.6软件建立数字回归模型,确定马鞭草中总黄酮最佳提取工艺条件,实验设计因素见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels tabe of response surface experiment

1.2.5 马鞭草总黄酮体外抗氧化试验

1.2.5.1 马鞭草总黄酮对DPPH自由基清除率的测定 将马鞭草浓缩液加无水乙醇配制成浓度分别为5、10、20、40、60、80 μg/mL的样品溶液。精密移取2 mL样品溶液于试管中,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL,充分混匀,室温下避光反应30 min,以无水乙醇为空白对照,于517 nm波长处测定其吸光度[20],平行测量3次。以抗坏血酸为阳性对照,精密称取一定量的抗坏血酸配制成相应浓度,按上述方法操作。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100

1.2.5.2 马鞭草总黄酮对羟自由基清除率的测定 采用邻二氮菲法测定羟自由基的清除率,取5 mmol/L邻二氮菲溶液1.5 mL置于10 mL的具塞试管中,加入2 mL 0.75 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),混匀后加入1 mL 0.75 mmoL/L的FeSO4溶液,充分混匀后加入1 mL不同浓度的供试液,再加入1 mL 1% H2O2溶液,然后加蒸馏水补足到10 mL,混匀,在37 ℃水浴下反应1 h,空白组既不加样品溶液又不加H2O2,对照组加H2O2溶液而不加样品溶液的吸光度。以于536 nm波长下测定吸光值[21]。以抗坏血酸为阳性对照,精密称取一定量的抗坏血酸配制成相应浓度,按上述方法操作。

羟自由基清除率(%)=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100

1.3 数据处理

运用Origin 8.0及Design Expert 8.0.6软件进行数据整理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度的选择 图1表明,当乙醇浓度在30%～50%之间,马鞭草中总黄酮含量随乙醇浓度的增加而增大;当乙醇浓度为50%时总黄酮含量达到最大,继续增加乙醇浓度时,总黄酮含量下降。原因可能是随着乙醇浓度增大,黄酮类化合物达到饱和,由于醇溶性杂质“色素”等亲脂性强的成分溶出量增加,与黄酮类化合物竞争同溶剂结合,从而导致黄酮的提取含量下降[23]。因此本实验选取乙醇浓度为40%、50%、60%进行优化。

图1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on content of total flavonoids

2.1.2 料液比的选择 马鞭草中总黄酮的含量随着料液比的增加而逐渐增加且趋于平缓。原因有可能是:料液比过小,黄酮类化合物溶解不充分;料液比过大,则样品中一些非黄酮类的化合物溶解度增大,与黄酮类化合物竞争性溶出,从而使其含量趋于平缓,由于提取液体积的增大会增加蒸发浓缩的能耗和工耗,为降低成本,因此选择料液比1∶30、1∶35、1∶40 g/mL三个水平进行优化。

图2 料液比对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of the ratio of water to materials on content of total flavonoids

2.1.3 提取时间的选择 由图4可知,在2 min时,总黄酮含量最高,在此之后总黄酮含量随时间的延长逐步下降,原因可能是随着时间的延长,闪式提取过程中发热,有利于总黄酮的溶出,但是黄酮类物质在长时间高温下会受到一定程度的破坏,因此提取量出现下降趋势。考虑到闪式提取一次提取时间最长不超过2 min，时间长于2 min时，需要连续多次提取，且在1 min时的总黄酮含量与2.5 min时基本上一致，故选择提取时间1、1.5、2 min三个水平进行优化。

图3 提取时间对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of extracting time on content of total flavonoids

2.1.4 提取次数的选择 由图4可知,随着提取次数的增加,多酚的含量逐渐增大且趋于平缓,但溶剂的消耗量增大,同时增加蒸发浓缩的能耗和工耗,为降低成本,考虑到效益诸多方面的因素,故选择提取次数为1次、2次、3次三个水平进行优化。

图4 提取次数对总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of extraction times on content of total flavonoids

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面回归模型建立与分析 采用Box-Behnken的中心组合原理为依据,以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为自变量,总黄酮的含量为因变量,采用4因素3水平响应面优化提取工艺,利用统计学分析软件Design Expert8.0.6软件建立数字回归模型,确定马鞭草中总黄酮最佳提取工艺条件,结果见表2。得回归方程Y=8.13+0.32A+0.46B+0.48C+0.16D+0.39BC-1.15A2-1.06B2-1.18C2-1.13D2

表2 响应面试验结果及分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance

模型中因素一次项B和C,二次项A2、B2、C2和D2对马鞭草总黄酮含量有极显著的影响(p<0.001),一次项A、交互相BC对马鞭草总黄酮的含量有高度显著影响(p<0.01),一次项D对马鞭草总黄酮的含量有显著影响(p<0.05),各因素对马鞭草中总黄酮含量的影响依次为:提取时间(C)>料液比(B)>乙醇浓度(A)>提取次数(D)。

2.2.2 响应面交互作用分析与优化 响应曲面坡度越陡峭,说明响应值对于该因素的改变越敏感,而曲面坡度越平滑,该因素的改变对响应值的影响也就越小,各因素交互作用对马鞭草中总黄酮含量影响的响应曲面以及等高线如图5所示。提取时间和料液比两个因素随取值的变化,其效应曲面线变化比较陡峭,表明这两个因素对马鞭草总黄酮的提取的交互影响作用显著,乙醇浓度和料液比、乙醇浓度和提取时间、乙醇浓度和提取次数、料液比和提取次数、提取时间和提取次数对总黄酮含量的交互影响作用不显著,这与表3中交互项值的分析一致。

图5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response surface plot of interaction of various factors

2.3 最佳工艺验证

通过回归模型得出马鞭草中总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度51.6%,料液比为1∶36.3 (g/mL),提取时间为1.51 min,提取次数为2次,在此条件下,总黄酮的含量为8.280 mg/g,综合考虑将其最佳工艺条件调整为乙醇浓度50%,料液比为1∶35 (g/mL),提取时间为1.5 min,提取次数为2次,以此条件进行3次重复性试验,测得马鞭草中总黄酮的含量为(8.282±0.003) mg/g,RSD=0.29%,由此可说明模型和方法的可行性和有效性良好。

2.4 体外抗氧化活性

2.4.1 对DPPH自由基的清除能力 不同浓度的马鞭草总黄酮提取液与VC溶液对DPPH自由基清除能力如图6所示。从图6中可以看出,马鞭草总黄酮对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加而升高,当其浓度为60 μg/mL时,清除率达到74.8%,此后,清除率基本保持不变。在实验浓度范围内,阳性对照物抗坏血酸在实验浓度范围内对DPPH自由基的清除能力始终高于马鞭草总黄酮。

图6 不同浓度的马鞭草总黄酮和抗坏血酸对DPPH·的清除率Fig.6 DPPH·scavenging activities of VC and total flavonoids

2.4.2 马鞭草总黄酮对羟自由基的清除能力 不同浓度的马鞭草总黄酮提取液与VC溶液对羟自由基清除能力如图7所示。马鞭草总黄酮对羟自由基具有一定的抑制能力，但不如VC,当马鞭草总黄酮浓度为60 μg/mL时,清除率为43.2%,此后,随着浓度的增加,清除率基本保持不变。在实验浓度范围内,阳性对照物抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力始终高于马鞭草总黄酮。

图7 不同浓度的马鞭草总黄酮和抗坏血酸对羟自由基的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of VC and total flavonoids

图8 不同浓度的马鞭草总黄酮和抗坏血酸对自由基的清除率 activities of VC and total flavonoids

3 结论

通过采用响应面法优化马鞭草中总黄酮的闪式提取工艺,以马鞭草中总黄酮含量为响应值进行响应面分析,得到最佳提取工艺条件为:乙醇浓度50%,料液比为1∶35 (g/mL),提取时间为1.5 min,提取次数为2次,在此条件下,总黄酮含量达到(8.282±0.003) mg/g,与模型预测值8.280 mg/g相近。与该方法可为马鞭草中总黄酮的研究提供一定的基础。马鞭草中总黄酮抗氧化活性试验表明随着马鞭草中总黄酮含量的增多,其抗氧化活性在一定范围内不断增加,为其在食品、药品等领域开发天然抗氧化剂提供一定的理论依据。