三种茶叶中多酚提取物的抑菌活性及其对致病菌膜渗透性的比较分析

, ,,,,紫薇

(哈尔滨商业大学药学院,细胞与分子生物学研究所,黑龙江哈尔滨 150076)

茶叶在我国具有悠久的历史,饮茶不仅可以提神醒脑还可以保健养生,深受人们的喜爱。茶多酚(Tea polyphenol,TP)是茶叶中多酚类物质的总称,又叫茶单宁或茶鞣质,主要包括黄烷醇(儿茶素)类、黄酮类、黄酮醇类、花色苷类和酚酸类等,其中儿茶素占60%～80%[1]。茶多酚是茶叶中有保健功能的主要成份之一[2-5],除具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、降脂、预防心血管疾病、护肝、抗衰老、调节综合免疫能力等多种药理作用外,还具有广谱而强效的抗菌作用,具有广阔的开发应用前景[6]。

目前,人们对于茶多酚及其抗菌作用的研究主要是茶多酚抗菌特性的研究,集中在茶多酚抑菌的种类、抑菌效果与影响因素等[7]。茶多酚对多种典型食品致病菌及腐败菌都有抑制作用,且与多种已知抗生素具有协同作用[7]。但是,对于不同种类茶叶的抑菌活性比较、茶多酚与细菌相互作用的研究还非常有限。另外,目前国内外对于茶多酚抑菌机制尚不十分清楚,使得茶多酚的应用缺乏科学的依据和指导,很大程度上限制了茶多酚在食品和医药领域的进一步推广。

由于生活在不同地域的人们对于茶叶的种类有所偏好,本文通过比较西湖龙井(绿茶)、铁观音(青茶)、普洱(黑茶)茶多酚的抑菌作用,并通过DNA渗透性实验评价茶多酚对各种致病菌细胞膜完整性的影响,进一步提取基因组DNA观察茶多酚提取物作用细菌前后对其DNA损伤的影响,并比较茶多酚提取物作用前后菌体蛋白和上清蛋白的变化,为茶多酚的深入研究和开发应用提供理论依据,为人们保健茶饮的选择及茶叶中活性成分的开发应用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(EscherichiacoliATCC 8739)、金色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusATCC 6538);枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisATCC 6633)、肠炎沙门氏菌(SalmonellaenteritidisATCC13076)、铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 14442)、变异链球菌(StreptococcusmutansATCC 35668) 哈尔滨商业大学细胞与分子生物学研究所保存;西湖龙井 杭州茶厂有限公司;铁观音 杭州忆江南茶叶有限公司;普洱茶 云南茶树王茶叶有限公司;茶多酚标准品(≥98%) 西安玉泉生物科技有限公司;氨苄青霉素 Sigma;细菌DNA提取试剂盒、SDS、聚丙烯酰胺、1Kb DNA ladder 天根生物科技有限公司;营养肉汤培养基、琼脂粉 北京奥博星生物技术有限责任公司;其它试剂 均为分析纯。

FUSION FX5凝胶成像系统 VILBER;SX-700型高压灭菌锅 TOMY;ELx800酶标仪 BioTek;HALO DB-20紫外分光光度计 Dynamica;洁净工作台HDL北京东联哈尔仪器有限公司;BP-9082精密恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶多酚的提取及含量测定 采用热水浸提法,茶叶干品经粉碎机粉碎后,过80目筛,料液比1∶20 g/mL,80 ℃,浸提30 min,重复3次,合并提取液后抽滤除渣,取滤液用等体积氯仿萃取,上层为茶多酚水溶液层,下层为氯仿层,重复3次。氯仿相用乙酸乙酯萃取,将乙酸乙酯层通过旋转蒸发仪(45 ℃，100 r/min)浓缩后挥发,得到茶多酚浸膏粗品。

取茶多酚标准品,配制浓度为0.1 mg/mL茶多酚溶液,分别取0、200、400、600、800 μL于容量瓶中,用蒸馏水定容至20 mL。再次稀释,使茶多酚标准品浓度为0.00025、0.0005、0.00075、0.001 mg/mL。以蒸馏水为对照,分别测得274 nm下的吸光光度值。以吸光度A对茶多酚标准的浓度绘制工作曲线,带入所提取茶多酚的吸光度值求得浓度,并计算茶多酚的含量。茶多酚的标准曲线为Y=754.8x+0.017,R2=0.9997,根据标准曲线方程计算茶多酚的浓度C。

式(1)

式中:M为茶叶粗粉质量(g);C为茶多酚溶液浓度(mg/mL);V-茶多酚溶液体积(mL)。

1.2.2 茶多酚提取物抑菌活性的测定

1.2.2.1 抑菌圈的测定 采用滤纸片法对不同茶叶中茶多酚提取物进行抑菌活性研究。用打孔器将定性滤纸打成6 mm直径的圆片,置于培养皿中灭菌,无菌条件下在营养琼脂培养基上涂布100 μL浓度107CFU/mL致病菌菌悬液,反复涂布3次使菌液涂布均匀,将浸泡30 min茶多酚提取液(4 mg/mL)的灭菌滤纸片摆放于培养基上,阳性对照为氨苄青霉素(0.4 mg/mL),37 ℃培养24 h后,观察记录结果,测量每一个抑菌圈的直径[8]。

1.2.2.2 MIC和MBC的测定 最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,简称MIC),指能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。通过二倍肉汤稀释法,采用96孔板,对茶多酚提取物进行抑菌活性研究,将茶多酚提取物溶于生理盐水,倍比稀释,得到样品浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL。分别加入105CFU/mL的致病菌,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假担孢菌、变异链球菌,37 ℃过夜培养12 h,观察菌液生长情况,菌液透明澄清时所对应的药液浓度即为MIC[9],实验重复3次。

最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration)简称MBC,指杀死99.9%的供试微生物所需的最低药物浓度。MBC是根据MIC的测定结果,选取MIC、2MIC和4MIC对应样品的菌液,并点植于营养琼脂培养基上,37 ℃过夜培养12 h,观察病原菌生长状况,不生长菌落对应的最低药物浓度即为MBC[10]。

1.2.3 细胞膜渗透性实验 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假担孢菌、变异链球菌6种致病菌接种于营养肉汤于37 ℃ 120 r/min过夜培养至107CFU/mL,培养液经12000 r/min,离心2 min,弃上清,沉淀用0.5% NaCl溶液洗涤、重悬。分别加入3种不同浓度的茶多酚提取物(0.5MIC、MIC、2MIC),空白对照加入等体积的0.5% NaCl,37 ℃培养8 h,12000 r/min,离心2 min,取上清。在260 nm下测量紫外分光光度值[11]。实验重复3次。

1.2.4 DNA损伤实验 取过夜培养至107CFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养液,12000 r/min,离心2 min,弃上清,菌体用0.5% NaCl洗涤、重悬后,加入不同浓度的茶多酚(0.5MIC、MIC、2MIC),充分混匀37 ℃培养12 h。用细菌DNA试剂盒提取基因组DNA。用琼脂糖凝胶电泳法检测,凝胶成像系统观察不同浓度茶多酚对致病菌基因组DNA的损伤作用[12]。

1.2.5 蛋白质损伤及泄露实验 取过夜培养至107CFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养液,12000 r/min,离心2 min,弃上清,菌体用0.5% NaCl洗涤、重悬后,加入不同浓度的茶多酚(0.5MIC、MIC、2MIC),充分混匀37 ℃培养12 h。12000 r/min,离心2 min后,将菌体蛋白与上清蛋白分别加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)中,100 ℃水浴5 min,使之完全混合变性,用12%分离胶(1.5 mol/L Tris-HCl pH=8.8,10% SDS,10%过硫酸铵(APS),30 mol/L Tris-HCl,N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED),ddH2O)和4%浓缩胶(1.0 mol/L Tris-HCl pH=6.8,10% SDS,10% APS,TEMED,ddH2O)进行凝胶电泳。加样后,100 V为起始电压10 min后,120 V恒压1 h,考马斯亮蓝R-250染色约15 min,再用脱色液脱色,观察菌体及上清蛋白条带变化。

1.3 数据处理

应用SPSS统计软件包进行数据统计学处理。采用ANOVA方差分析并行方差齐性检验;结果以均值±标准差(n=3)表示。

2 结果与分析

2.1 茶多酚的含量

根据茶多酚含量计算公式得出西湖龙井、铁观音和普洱茶的茶多酚的含量分别为(48.12±3.22)、(37.36±2.64)和(31.61±1.92) mg/g,其中西湖龙井中的茶多酚含量最高。

2.2 茶多酚提取物的抑菌活性

从表1可以看出,三种茶叶中茶多酚提取物均具有明显的抑菌效果,其中西湖龙井抑菌效果最强,可通过进一步MIC和MBC的测定对抗菌效果进行评价。

表1 茶多酚提取物对致病菌抑菌直径的影响(cm)Table 1 Effect of tea polyphenol extract on antipathogenic bacteria diameter(cm)

从综合表1～表2中分析可知,3种茶叶茶多酚提取物均对6种常见致病菌具有较好的抑菌效果,其中西湖龙井与铁观音的抑菌效果最强,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC值为0.125、0.125 mg/mL,MBC值为0.25、0.25 mg/mL。由于表1中显示西湖龙井抑菌效果更明显,对金黄色葡萄球菌抑菌直径为(1.80±0.06) cm,结合抑菌圈直径、MIC和MBC结果及茶多酚含量推测,抑菌效果与茶多酚的含量具有一定的相关性,随着茶多酚含量的增加,抑菌效果更为明显。后续实验选取茶多酚含量较高的西湖龙井茶多酚提取物做进一步研究。

表2 茶多酚提取物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)(mg/mL)Table 2 MIC and MBC value of tea polyphenol extract(mg/mL)

2.4 细胞膜渗透性试验

选取西湖龙井茶多酚提取物为研究对象,通过对6种细菌培养物作用后,在260 nm下测量OD值,如图1所示,在茶多酚的作用下,随着药物浓度的增加,260 nm处的以DNA为主渗透物质含量逐渐升高,尤其是作用在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及变异链球菌中变化较为明显。有报道显示，儿茶素物质可结合细胞膜的磷脂双分子层,从而导致细胞膜的破坏。细菌细胞膜的破坏可削弱细菌与宿主细胞结合的能力,同时也抑制了细菌聚集结合形成生物膜,生物膜的形成与细菌的致病性和耐受性密切相关[13]。推测茶多酚提取物的抑菌作用与破坏细菌细胞膜并提高其渗透性有着一定的关联。

图1 茶多酚提取物的菌株DNA渗透性实验Fig.1 DNA permeability test of tea polyphenol extract on strain

2.5 DNA损伤实验

根据DNA渗透性实验结果,选取西湖龙井茶多酚提取物为研究对象,作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,经药物作用后提取基因组DNA,发现随着药物浓度的增加,无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌,其基因组DNA均呈现一定程度的弥散和降解,如图2所示,推测茶多酚提取物可能通过破坏细菌细胞膜,进一步对细菌DNA造成损伤,进而发挥其抑菌作用。

图2 茶多酚提取物的菌株DNA损伤实验Fig.2 DNA damage test of tea polyphenol extract on strain注:1～5为1kbDNA marker,2MIC、MIC、0.5MIC、空白组金黄色葡萄球菌DNA;6～10为DNA marker,2MIC、MIC、0.5MIC、空白组大肠杆菌DNA。

2.6 蛋白质损伤及泄露实验

选取西湖龙井茶多酚提取物为研究对象,作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,经药物作用后,随着药物浓度的增加,金黄色葡萄球菌的菌体蛋白出现一定程度的降解损伤,其中条带a与条带b可能对茶多酚更为敏感,蛋白表达具有较明显的下降趋势。随着药物浓度的增加,菌体上清蛋白中c条带与d条带具有表达上扬趋势,但当药物浓度达到MIC以后,降解程度不再增加,说明菌体细胞膜随药物浓度增大逐渐发生损伤,引起菌体蛋白的泄露,当药物浓度达到一定值时,蛋白泄漏处于相对稳定状态(图3A)。大肠杆菌的菌体蛋白随药物浓度有轻微的降解损伤,变化不明显。在对菌体上清蛋白的观察中发现e条带、f条带与g条带出现一定的上扬趋势,表明菌体上清蛋白出现一定程度的泄漏,尤其是当药物浓度达到MIC时,菌体蛋白泄漏程度最大,随着药物浓度继续加大,反而蛋白质泄漏不再增加(图3B)。这一现象可能与革兰氏阳性菌与阴性菌的细胞壁结构有关。大肠杆菌为革兰氏阴性菌,其细胞壁存在外膜结构,对细菌细胞膜起到一定的保护作用。

图3 茶多酚提取物的对菌体蛋白损伤及上清蛋白泄露实验Fig.3 The experiment of tea polyphenol extract on protein-damage and supernatant leakage注:A中M:蛋白质marker,1～4:2MIC、MIC、0.5MIC、空白组金黄色葡萄球菌菌体蛋白,1′-4′:0.5MIC、MIC、2MIC空白组金黄色葡萄球菌上清蛋白;B中M:蛋白质 marker,1-4:2MIC、MIC、0.5MIC、空白组大肠杆菌菌体蛋白,1′-4′:0.5MIC、MIC、2MIC空白组大肠杆菌上清蛋白。

3 讨论

茶叶作为一种保健饮品有着悠久的历史,不同的茶叶中其保健成分与保健效果也有着一定的差异。茶叶组成成分由于不同种类的茶叶发酵程度不同,其成分含量也不同。其中绿茶为不发酵茶,青茶为半发酵茶,黑茶为后发酵茶。在发酵过程中,由于酶的作用,使得茶叶中的一些成分发生氧化和降解。特别是茶叶中多酚类物质,由于酶的氧化逐渐产生茶红素、茶黄素和茶褐素[14-17]。因此,对黑茶来说,茶色素含量增多,茶多酚含量减少。

茶多酚中主要成分为儿茶素类,包括表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)4种。曾亮等[18]研究发现,儿茶素对革兰氏阳性菌的抑制率比阴性菌高,效果更加明显。热稳定性测定发现当温度为25～80 ℃时,儿茶素的抑菌效果最好,且不受温度的影响。儿茶素在酸性条件下比在碱性条件下稳定。研究也证实,茶多酚可抑制或杀死金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌、痢疾杆菌和霍乱弧菌等[19]。

研究表明,不同种类的细菌对多酚的耐受力不同,取决于多酚类物质结构以及细菌种类。茶多酚的4种主要儿茶素物质由于结构不同,其抗菌活性也不尽相同,表现出的抗菌活性强弱顺序为 EGCG>ECG>EGC>EC[20]。茶多酚一般为含有两个以上互为邻位的羟基多元酚,其基本结构是C6-C3-C6碳架,酯型儿茶素较简单儿茶素的抑菌效果更强,其分子结构中比简单儿茶索多结合1～2个没食子酰基。其抑菌机理为茶多酚结构中的酚羟基可与蛋白质分子中的氨基或羧基结合,其疏水性的苯环结构也可与蛋白质发生疏水结合,茶多酚与蛋白质之间的这种多点结合作用阻止了细菌的侵染,使其具有抑菌性。·OH基团与菌体内的二氢叶酸合成酶肽键上的氨基酸残基结合,使二氢叶酸合成酶失活,影响细菌的核酸合成,进而使细菌的生长繁殖受到抑制[21]。

本研究结果表明,3种茶叶茶多酚提取物中,抑菌效果最强的为绿茶,之后为青茶,最后为黑茶,与华德兴[22]的研究结果一致。茶叶中的主要抑菌成分为茶多酚,茶多酚含量的高低与抑菌作用的强弱有关。茶多酚也能够促进细菌细胞膜渗透性的发生,使其内容物发生泄露,并且使细菌DNA及菌体蛋白发生一定程度的损伤。对于茶多酚中主要的化合物:EC、EGC、EGCG和ECG抑菌作用比较及机制的研究也是我们课题组今后关注的内容。

4 结论

通过对西湖龙井、铁观音和普洱茶三种茶叶进行茶多酚的提取、抑菌活性比较以及细胞膜渗透性实验,结果显示，西湖龙井茶多酚提取物抑菌效果最优。随着茶多酚提取物浓度的增加,260 nm下的细菌渗透性物质逐渐增多,并且基因组DNA的损伤程度逐渐增大,菌体蛋白质发生一定程度的损伤,且在革兰氏阳性菌中损伤更明显。本实验表明，不同种类茶叶中茶多酚含量与其抑菌效果有关,为深入研究茶叶保健功能及抑菌机理研究提供了实验依据。