基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器检测牛奶中黄曲霉毒素M1

郭婷，林淑凤，马良，谭红霞，张宇昊

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

目前，乳及乳制品受到黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)污染的现象越来越严重。2011年国家质检总局抽检某批次纯牛奶AFM1超标140%；2012年广州工商局抽检发现部分幼儿奶粉AFM1含量超标；2014年国家食药监总局公布抽检的部分奶粉样品AFM1超标。AFM1是哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AF B1)污染的饲料后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，通过细胞色素P-448调节作用，其末端呋喃环C-10被羟化而生成AFM1存在于动物分泌的乳汁和尿液中，以乳中最为常见[1]。AFM1被世界卫生组织列为I类致癌物，具有强致癌性和致突变性。中国、美国等国家规定乳及乳制品中AFM1最大限量为0.5 μg/kg[2]，欧盟规定生乳中AFM1的最大限量为0.05 μg/kg，婴儿配方乳粉中为0.025 μg/kg[3]。

目前AFM1检测方法主要有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[4-9]、免疫亲和层析法(immunoaffinity chromatography，IAC)[10-12]、酶联免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)[13-14]等。其中色谱检测方法灵敏，稳定性强，但样品前处理复杂，成本高，不能满足目前食品安全快速检测的要求。ELISA法操作简便、用时短，但抗体的制备周期较长且稳定性差。与其相比，适配体可体外合成，稳定性好，在食品安全检测领域显示了巨大的应用前景。

近年来，越来越多的科研工作者构建基于适配体的传感器[15-18]。YANG等[19]使用未修饰的金纳米粒子(AuNPs)作为指示剂,实现对赭曲霉毒素(ochratoxin,OTA)的快速检测。当工作液中没有OTA时，适配体吸附在AuNPs表面，在盐溶液中保护AuNPs，未发生聚集现象，溶液为红色。当加入OTA后，适配体与OTA结合从而构象变化形成G-四联体结构，而AuNPs在在盐诱导下发生聚集导致颜色变化。BONEL等[20]开发了一种竞争性电化学传感器用来检测OTA。对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的活性反应进行检测，根据活性变化检测OTA。GUO等[21]利用PCR技术结合适配体实现了AFB1的痕量检测，检测限为25 fg/mL。

荧光传感器因其简便、高灵敏、快速等优点而被广泛的应用于检测领域[22-26]。随着纳米技术的快速发展，越来越多的纳米材料(石墨烯、碳纳米管、二硫化物等[27-32])应用在荧光传感器方面。GUO等[33]开发一种基于单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)的荧光传感器用于检测OTA。利用荧光染料修饰适配体，SWNTs对染料具有很强的猝灭效果；但当加入OTA时，其与适配体结合，使得适配体从SWNTs表面释放下来，荧光恢复。LV等[34]在以上实验基础上利用DNA酶进行信号放大，进一步提高了检测的灵敏度。然而，在实际荧光检测过程中，工作液中混合纳米材料及目标物等多种物质，纳米材料的存在增加本底值的干扰，影响检测灵敏度。

磁性纳米材料因其较大的比表面积、磁性分离效果等特性，受到越来越多的科研工作者关注[35-37]。目前，使用Fe3O4磁性纳米颗粒作为荧光猝灭剂的传感平台研究报道较少。本研究以AFM1为目标物，FAM修饰的适配体为识别元件，利用磁性纳米材料的猝灭性及磁分离性能，构建基于适配体和磁性纳米材料的荧光传感器。检测机理如图1所示，FAM-适配体吸附在Fe3O4表面发生能量共振转移，造成FAM-适配体的荧光猝灭；当体系中加入AFM1时，FAM-适配体与AFM1结合，FAM-适配体从Fe3O4表面脱附，荧光恢复。

图1 传感器的传感机理Fig.1 Illustration of sensor

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外分光光度计(UV-2450),日本岛津公司；荧光分光光度计(F-2500),日本日立公司；台式高速离心机,德国Eppendorf公司； 透射电子显微镜(JEM-1200EX),日本电子株式会社。

FAM-适配体(5′-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3′)，生工生物工程(上海)有限公司；Tris,赛国生物科技有限责任公司；HCl,重庆川东化工有限公司；FeCl3·6H2O，氨水、甲醇、NaCl、乙腈、二氯甲烷,成都市科龙化工有限公司； FeCl2·4H2O,天津市大茂化学试剂厂； AFM1、AFB1、展青霉毒素(PAT)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、单端孢霉烯(T-2)毒素标准品,美国Sigma公司；纯牛奶,购于本地超市，250 mL；营养奶粉,购于本地超市，400 g；脱脂牛奶,购于本地超市，1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 Fe3O4磁性纳米颗粒的合成

采用液相共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，将12.16 g FeCl3·6H2O与4.97 g FeCl2·4H2O溶解于200 mL蒸馏水中，剧烈搅拌并缓慢加入氨水，调节pH至9.0左右，于80 ℃熟化30 min得到Fe3O4粒子黑色溶液，用永磁体收集并用超纯水和乙醇交替洗涤后冷冻干燥，得到干燥黑色固体粉末。

1.2.2 DNA浓度测定

DNA浓度以单链浓度表示，利用紫外-可见分光光度计测定DNA在260 nm处的吸光度，依据朗伯比尔定律(A=εbc)计算得DNA的浓度，配置成100 nmol/L(Tris-HCl pH 8.0)的溶液，于-20 ℃备用。

1.2.3 荧光传感器对AFM1的检测

DNA备用溶液解冻后，水浴90 ℃处理10 min，逐渐冷却至室温备用。将Fe3O4溶液加入工作液(100 nmol/L DNA溶液)中，再将一定浓度的FAM1加入工作液中作用20 min，利用磁铁分离。取清液测定荧光光谱(激发波长480 nm)。

1.2.4 实际样品中AFM1的检测

向样品中加入一定量的AFM1，分别配成质量浓度为0.25、0.50、0.75 μg/L的阳性样本。(1)液体样品：取5 mL液态样品(纯牛奶和脱脂牛奶)置于离心管中，加入10 mL甲醇和0.5 g NaCl后旋涡振荡混匀30 s，在37℃下超声5 min，离心后取上清液过0.22 μm有机微孔滤膜得一定体积微萃取工作液；(2)固体样品：称取1 g固体样品(奶粉)置于离心管中，加入5 mL水，旋涡混匀后，加入10 mL甲醇和0.5 g NaCl并旋涡振荡混匀30 s，在37 ℃下超声5 min，离心后取上清液过0.22 μm有机微孔滤膜得一定体积微萃取工作液。将1 mL微萃取工作液、200 μL分散剂乙腈和60 μL萃取剂二氯甲烷加入离心管中，旋涡混匀成均匀的乳浊液，静置1 min，离心后抽取下层有机相CH2Cl230 μL于试管中，37 ℃水浴氮吹。将干燥物溶解于Tris-HCl缓冲液中制成样品溶液。然后按照构建的荧光传感器检测。另外，根据国家标准采用液相色谱法进行方法对照实验。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4磁性纳米颗粒的制备及表征

采用液相共沉淀法制Fe3O4磁性纳米颗粒的反应原理如下：

Fe2++2Fe3++8OH-=Fe3O4+4H2O

Fe2+与Fe3+在碱性条件下高温处理，合成黑色Fe3O4磁性纳米颗粒。利用透射电子显微镜对其进行表征，具体表征结果如图2-A所示。结果显示该方法制备的Fe3O4粒径约为8～15 nm。图2-B显示Fe3O4的磁滞回归线，说明该Fe3O4具有良好的磁分离能力，能够快速完成分离效果。

图2 Fe3O4磁性纳米颗粒的透射电镜图(A)和磁滞回归线(B)Fig.2 TEM images(A) and magnetization curves of Fe3O4(B)

2.2 检测原理

本研究以AFM1为研究对象，构建荧光传感器。将染料FAM修饰在适配体的一端，其荧光光谱图如图3曲线a。加入Fe3O4溶液后，FAM-适配体通过静电相互作用吸附在Fe3O4表面，Fe3O4与FAM-适配体发生荧光共振能量转移，荧光信号猝灭，如图3曲线d所示；当体系中加入AFM1时，FAM-适配体与AFM1识别并形成一定结构，致使FAM-适配体从Fe3O4表面脱附，荧光信号恢复，如图3中曲线c所示。

a-FAM-适配体;b-FAM-适配体+AFM1;c-FAM-适配体+Fe3O4+AFM1;d-FAM-适配体+Fe3O4;e-AFM1图3 不同条件下荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra under different conditions

因此，可以通过检测荧光信号强弱与体系中AFM1的浓度的关系，实现AFM1的定量检测。

2.3 检测条件优化

2.3.1 Fe3O4浓度

Fe3O4与FAM-适配体浓度比例在很大程度上影响会影响荧光传感器的灵敏度，因此考察二者的浓度比显得十分重要。如图4所示，含有100 nmol/L的FAM-适配体的缓冲溶液中，荧光强度随Fe3O4浓度的增加而急剧降低，当Fe3O4质量浓度到达0.35 mg/mL时，荧光强度趋于稳定，当Fe3O4质量浓度继续增加时，对FAM-适配体荧光的猝灭效果没有显著影响，且过量的Fe3O4会降低传感器的灵敏度。因此，选用0.35 mg/mL作为在后续实验中Fe3O4浓度。

不同质量浓度Fe3O4下FAM-适配体的荧光光谱(a-0.1、b-0.2、c-0.3、d-0.35、e-0.4、f-0.45、g-0.5、h-0.6、i-0.8 mg/mL)图4 不同质量浓度Fe3O4对体系荧光强度的影响Fig.4 Effect of different concentrations of Fe3O4 on the fluorescence

2.3.2 荧光恢复时间

实验中添加AFM1后需要孵育一段时间才能引起荧光信号恢复，本实验研究了孵育时间0～80 min的荧光恢复情况。如图5所示，随着FAM-适配体和AFM1孵育时间的延长，荧光强度逐渐增加，20 min后趋于稳定。因此本研究选择20 min最佳荧光恢复时间。

插图：不同孵育时间对应的FAM-适配体(100 nmol/L)的荧光光谱(a-80、b-60、c-50、d-40、e-30、f-20、g-15、h-10、i-5、j-0 min)图5 不同孵育时间对荧光恢复的影响Fig.5 Effect of incubation time on fluorescence intensity

2.4 荧光传感器的构建

在上述优化实验条件下，以AFM1为目标构建荧光传感器。在荧光传感器中，加入不同浓度AFM1溶液。研究发现，在一定浓度范围内，随着AFM1质量浓度的增大，AFM1与更多的FAM-适配体结合，脱离Fe3O4，荧光强度逐渐恢复，如图6所示。然而，当AFM1的质量浓度达到一定值时，荧光强度不再明显增加，达到平衡。荧光强度与AFM1质量浓度范围在0.05～0.70 μg/L范围内呈线性关系，检出限为0.02 μg/L。

AFM1质量浓度a-0.05、b-0.1、c-0.2、d-0.3、e-0.4、f-0.5、g-0.6、h-0.7、i-0.8、j-0.9、k-1.0 μg/L图6 不同浓度AFM1对所构建传感器荧光响应变化(A)和荧光与AFM1浓度的线性关系(B)Fig.6 Fluorescence spectrum of sensor with different concentrations of AFM1(A) and relationship between F and concentrations of AFM1(B)

2.5 荧光传感器选择性

为了研究荧光传感器的选择性，本研究以AFB1、OTA、DON、PAT、T-2为对象考察该传感器的特异性。结果如图7所示，当加入0.5 μg/L AFM1时，荧光强度显著增加。加入10 μg/L对照毒素时荧光强度没有出现明显增强。结果表明本研究所构建的传感器对AFM1有较好的特异性。

图7 方法选择性Fig.7 Selectively of sensing systemAFM1质量浓度为0.5 μg/L，其他对照毒素质量浓度均为10 μg/L

2.6 实际样品测定

为了考察传感器实际测定效果，我们以纯牛奶、脱脂牛奶和奶粉作为实际阴性样品，研究加标回收情况，并用液相色谱法进行对照实验。结果如表1所示，利用传感器检测的加标回收率在82.5%～102.3%的范围内，这说明该荧光传感器可用于真实复杂样品中AFM1的测定。

3 结论

本研究构建一种基于适配体和磁性纳米材料的荧光传感器，可用于高灵敏度、高特异性检测AFM1。在最优条件下，传感器的线性范围0.05～0.70 μg/L，检测限为0.02 μg/L。且在实际样品检测中同样表现出较好的效果，说明本检测方法在食品安全检测中具有较强的实用性。为开发快速、灵敏和高选择性的食品安全生物传感器开辟了新的途径。

表1 实际样品加标回收率(n=3)Table 1 Real sample spike recovery (n=3)