超声联合杀菌对火龙果汁品质及抗氧化性的影响

王振帅，曾秋烦，信思悦，陈善敏，盛怀宇，蒋和体

(西南大学 食品科学学院，重庆，400716)

火龙果(Pitaya)，又叫红龙果、仙蜜果等，是仙人掌科量天尺属和蛇鞭柱属的栽培品种[1-2]，主要有红皮白肉、红皮红肉和黄皮白肉火龙果3个品种[3]。最早起源于巴西、墨西哥等中美州地区，之后传到越南等东南亚国家以及中国台湾，目前我国火龙果种植地区主要分布在海南、福建、云南等地[4-5]。火龙果富含水溶性膳食纤维、维生素E、植物多糖、矿物质元素、不饱和脂肪酸等，具有降低血糖、血压和润肠道的作用，还能调节人体各项机能，提高免疫力，具有预防大肠癌的功能[6-7]。

火龙果采后在自然条件下极易失水和腐烂，不耐贮藏，研究表明白肉火龙果比红肉火龙果贮藏期稍长，所以对红肉火龙果的深加工显得尤为重要[8]。红肉火龙果汁本身含有的腐败微生物在贮藏期间极易造成果汁变质，所以杀菌技术的应用极为重要。常见的热杀菌技术有巴氏杀菌、超高温瞬时杀菌(ultra high temperature treated，UHT)，但是热杀菌极易损失产品中的热敏性营养成分，降低产品的品质。超声波杀菌属于非热杀菌技术，大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、绿脓杆菌对超声非常敏感，可被完全杀死，但超声对葡萄球菌、链球菌等效果较小[9]。研究表明超声波-低热联合[10]、超声波-氯联合[11]、超声波-二甲基二碳酸盐联合[12]均有较好的杀菌效果，并对产品品质影响较小。当超声波应用于果汁杀菌时，其能量可瞬间分布于果汁中，空穴气泡绝热收缩至爆破的瞬间过程，产生“热点”效应，导致细胞膜在变化的压强条件下拉伸，破裂，并伴有膜电位的改变，因而在中低温条件下具有显著的杀菌效力，达到减缓热效应(降低热杀菌温度)和降低能耗的效果[13-14]，秦艳红等[15]使用超声200 W、40℃、30 min处理樱桃番茄汁，一定程度上延长了货架期；王文宗[10]探讨了超声-低热联合对胡萝卜汁的杀菌效果及其机理研究。微波杀菌具有热效应和非热效应双重效果，但其对总酚及黄酮损失量较大，所以进行超声预处理，一方面可增加多酚含量[16]，另一方面缩短微波时间，增加抗氧化活性物质保留量。本研究采用超声-微波联合杀菌(ultrasonic - microwave combination sterilization，UMC)、超声-中温联合杀菌(ultrasonic-moderate temperature combination sterilization，UMTC)，对比巴氏杀菌，通过比较杀菌后火龙果汁的理化性质、抗氧化性，分析不同杀菌技术对火龙果汁品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红肉火龙果，购于永辉超市；果胶酶，诺维信生物技术有限公司；平板计数培养基，北京奥博星生物技术责任有限公司；芦丁，中国药品生物制品检定所；没食子酸，上海源叶生物科技有限公司；Folin-酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸、HCl、NaOH、水杨酸，重庆川东化工(集团)有限公司；酒石酸钾钠、葡萄糖、2,6-二氯靛酚、CH3COONa、KCl、Na2CO3、NaH2PO4、无水乙醇、FeSO4、H2O2、三氯乙酸，成都市科龙化工试剂厂；DPPH，分析纯，Sigma公司；BHT，阿达玛斯试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计(7200)，尤尼柯(上海)仪器有限公司；无菌操作台(VD-650)，苏州净化设备有限公司；电热恒温水浴锅(HWS-26)，上海齐欣科学仪器有限公司；全自动色差仪(UltraScan PRO)，美国Hunter Lab公司；手持糖度仪(PAL-1)，上海上天精密仪器有限公司；超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；陶瓷螺旋压榨机(JYZ-B530)，九阳股份有限公司；电子天平(FA2004)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；微波炉：广东格兰仕微波炉电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 火龙果汁制备工艺流程

红肉火龙果→清洗去皮→切块榨汁→灭酶(微波550 W、3 min)→果胶酶酶解(添加量0.06%、酶解时间2.0 h、温度55 ℃)→果胶酶的钝化(微波700 W、30 s)→过滤得果汁(pH为4.42)→杀菌→快速冷却→指标测定

1.3.2 杀菌方法

巴氏杀菌[17]：将制备好的火龙果汁水浴加热到中心温度为95 ℃后开始计时，时间为2 min；装入已灭过菌的耐高温PET瓶中，流水下快速冷却至室温。

UMC杀菌[16，18]：将超声功率、超声时间、微波功率、微波时间进行单因素及响应面实验，以菌落总数、褐变指数、总酚为评判指标，最后处理条件为功率200 W，20 min，然后放入微波炉中，功率为700 W，1.5 min，无菌罐装后快速冷却至室温。

UMTC杀菌：参考文献[15]并进行优化，将制备好的火龙果汁置于超声中，超声功率为200 W，50 ℃，20 min，杀菌后无菌罐装并快速冷却至室温。

1.3.3 指标检测

1.3.3.1 微生物检测

以菌落总数作为微生物检测指标，采用平板计数法，具体参考GB 4789.2—2016的相关规定[19]。

1.3.3.2 可溶性固形物测定

根据SB/T 10203—1994，使用手持糖度计直接测定可溶性固形物含量(°Brix)。

1.3.3.3 总糖、总酸的测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法[20]测定果汁的总糖；采用直接滴定法测定总酸，结果以柠檬酸计。

1.3.3.4 Vc含量、花色苷含量测定

Vc含量采用2,6-二氯靛酚法测定[21]；花色苷含量采用pH示差法测定[22]。

1.3.3.5 褐变指数测定[23]

取5 mL火龙果汁，加入15 mL 80%乙醇，混匀并置于室温下避光反应30 min，4 ℃条件下4 000 r/min离心20 min，取上清液于420 nm处测定吸光度，以80%乙醇溶液作为空白。

(1)

式中：A为吸光值，V1为提取液体积，mL，V2为样品体积，mL。

1.3.3.6 色泽测定[24]

采用UtraScan PRO测色仪(总透射模式) 测定火龙果汁色泽。色泽参数分别为亮度值L*、红绿值a*、黄蓝值b*，以未杀菌鲜榨汁为对照组，同一个样品测3次，取其平均值。按公式(2)计算ΔE总色差值:

ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2

(2)

1.3.3.7 总酚含量测定

采用福林酚法，测定方法参考文献[25-26]。以没食子酸为标准物，绘制标准曲线，得线性方程：y=0.097 1x+0.027 3，R2=0.994 3。取1 mL提取液测定吸光度，总酚含量以没食子酸计，单位mg/mL。

1.3.3.8 总黄酮含量测定

采用亚硝酸钠法[27]，以芦丁为标准物，得标准曲线方程为：y=0.012 7x+0.025 7，R2=0.977 4。取1 mL火龙果汁测定吸光度，总黄酮含量表示为芦丁当量，单位mg/mL。

1.3.4 抗氧化性的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率测定[28]

DPPH在乙醇溶液中会表现为深紫色，抗氧化剂与其单电子发生配对作用，从而使颜色逐渐消失，通过测定火龙果汁与其反应后吸光度变化从而判断抗氧化能力。火龙果汁稀释10倍，将其与0.2 mmol /L DPPH溶液各2.0 mL混合为实验组，与乙醇各2.0 mL混匀为空白组，以及乙醇与0.2 mmol /L DPPH溶液各2.0 mL混匀为对照组，避光放置30 min后于517 nm处测定吸光度(以乙醇调零)。按公式(3)进行计算:

(3)

式中：Ai为实验组吸光度；Aj为空白组吸光度；Ac为对照组吸光度。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除率测定[29]

利用火龙果汁抑制ABTS在氧化作用下生成ABTS+的颜色反应，测定出抗氧化能力。将ABTS自由基储备液用无水乙醇稀释吸光值为0.700±0.002 (734 nm处)，取ABTS自由基稀释液5.4 mL与0.6 mL稀释10倍火龙果汁混匀(蒸馏水替换火龙果汁设为对照)，在室温下反应10 min后，于734 nm波长下测定吸光值。按公式(4)进行计算。

(4)

式中：A1为实验组吸光值；A0为对照组吸光值。

1.3.4.3 羟自由基(·OH)清除率测定[17]

利用Fenton反应测定火龙果汁对Fe2+催化H2O2产生·OH自由基的清除能力。取9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液各1 mL，然后加入火龙果汁和8. 8 mmol/L H2O2溶液各1 mL，混匀避光放置10 min后于510 nm处测定吸光度。按公式(5)计算:

(5)

式中：A0为空白吸光值，参比溶液为不加H2O2的体系；Ax为加样品的吸光值，Ax0为不加H2O2的吸光值，

参比溶液为去离子水。

采用邻苯三酚自氧化的方法，取2.35 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值8.2)和2.00 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)加入3只比色管中，25 ℃水浴保温15 min。其中1只比色管加入4.50 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液0.15 mL，另1只加入4.50 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液0.15 mL和稀释10倍火龙果汁1 mL，最后1只加盐酸0.15 mL为调零管，立即混匀于320 nm波长下测定吸光度，测定3 min，每隔30 s记录1次。按公式(6)进行计算。

(6)

式中：ΔA1为邻苯三酚氧化速率，ΔA为加样品后邻苯三酚氧化速率。

1.3.5 感官品质评定[31]

对经过不同杀菌处理的果汁从色泽、风味、口感、组织状态及综合评价5个方面进行感官评定，邀请12名食品学院经过感官审评培训的学生组成评价小组，按照表1进行审评和打分。

表1 火龙果汁感官评分标准Table 1 The standard score sheet for the sensory evaluation of Pitaya juice

1.3.6 数据分析

每个实验处理重复3次，结果以平均值X±SD表示，利用SPSS 22.0软件进行显著性分析，P<0.05表示显著差异；应用Origin2017及Excel对所得数据进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌方式对菌落总数、总酸、可溶性固形物、总糖的影响

由表2可知，3种杀菌方式都有很好的杀菌效果，杀菌后菌落总数均已达到GB 7101—2015国家标准，其中UMC杀菌和UMTC杀菌效果较好，与巴氏杀菌有显著性差异(P<0.05)，UMC杀菌优于UMTC杀菌，但两者差异不显著(P>0.05)；不同杀菌方式对火龙果汁的总酸、总糖、可溶性固形物含量均没有显著影响，这一结果与文献[16,18]得出的结论相符合。

2.2 不同杀菌方式对Vc含量、花色苷、褐变指数的影响

3种杀菌方式对火龙果汁Vc含量、花色苷含量、褐变指数的影响如图1所示，火龙果汁中Vc含量经过3种杀菌方式均有不同程度的下降。与鲜榨汁相比，巴氏杀菌、UMC杀菌、UMTC杀菌下降比例分别为35.71%、12.60%、26.79%，UMC杀菌保留Vc含量效果最好，UMTC杀菌效果次之，两者均与巴氏杀菌有显著差异(P<0.05)。巴氏杀菌Vc含量损失最大，这可能是由于巴氏杀菌温度较高，使得Vc发生降解，造成Vc含量的大量损失。研究表明超声处理由于空穴效应能够消除溶解氧从而抑制Vc的有氧降解，同时也降低了脱氢抗坏血酸的积累水平，使无氧降解也得到间接抑制[32]，但是UMTC杀菌中温(50 ℃)加快了Vc降解的速度，造成Vc含量还是有一定程度的下降。

表2 不同杀菌方式对火龙果汁菌落总数、总酸、可溶性固形物、总糖的影响Table 2 Effects of different sterilization methods onaerobic bacterial count, total acid, soluble solids andtotal sugar of Pitaya juice

注：a,b,c,d表示同一列数值间的显著性差异(P<0.05)，表3同。

图1 不同杀菌方式对火龙果汁Vc含量、花色苷、褐变指数的影响Fig.1 Effects of different sterilization methods on Vc content, anthocyanins and browning index of Pitaya juice

花色苷化学性质不稳定，易受温度、光照、氧气等因素的影响，造成花色苷含量下降，使食品色泽发生变化。巴氏杀菌、UMC杀菌、UMTC杀菌花色苷含量分别下降43.18%、9.24%、24.22%，KECHINSKI等[33]研究发现随着温度升高，花色苷降解也随之加快，这一结论与实验结果一致。巴氏杀菌和UMTC杀菌因加热时间较长，所以花色苷损失程度较大，而UMC杀菌因微波处理时间很短而较好的保留了花色苷含量。

褐变指数是评价食品发生色泽变化的一个重要指标，由图1可知，经过巴氏杀菌的火龙果汁发生褐变程度最大，UMC杀菌和UMTC杀菌与其有显著性差异(P<0.05)，但两者之间差异不显著。巴氏杀菌由于高温产生的热效应会促使美拉德反应、焦糖化反应的发生以及抗坏血酸的降解，从而引起非酶褐变[34]。超声处理能够去除溶解氧从而抑制褐变，UMTC杀菌由于温度促进褐变发生，两方面共同作用从而达到一种平衡状态。而UMC杀菌减少了由温度作用导致的褐变反应，最大程度的保护了火龙果汁色泽。

2.3 不同杀菌方式对火龙果汁色泽的影响

表3为3种杀菌方式对火龙果汁色泽的影响，由表3可知，巴氏杀菌的L*值和a*值均显著性下降，火龙果汁色泽变暗，红度变浅，这可能是因为Vc降解、色素变化等导致果汁发生褐变，亮度值减小；UMC杀菌L*值增加，a*值下降，即火龙果汁亮度增加，红度变浅，表明超声能改善火龙果汁的亮度，同时颜色变浅是由超声波产生的OH-引发呈色物质的氧化还原反应与异构化引起的[35]；UMTC杀菌L*值下降，a*值下降，表现为暗红色是由于超声作用与中温共同作用所导致。3种杀菌方式处理过的火龙果汁b*值均显著性增长，黄度加深。ΔE表示色泽变化程度，ΔE值越大，说明颜色变化越大，UMC杀菌的ΔE值最大，但其能改善亮度，较好的保护火龙果汁的色泽。

表3 不同杀菌方式对火龙果汁色泽的影响Table 3 Effect of different sterilization methods on thecolor of Pitaya juice

2.4 不同杀菌方式对火龙果汁总黄酮和总酚含量的影响

由图2可知，3种杀菌方式处理的果汁总黄酮含量均为下降状态，巴氏杀菌、UMC杀菌、UMTC杀菌分别下降21.23%、9.49%、15.99%，UMC杀菌保留总黄酮含量效果最好；相比鲜榨汁，巴氏杀菌的总酚含量显著性下降(P<0.05)，而UMC杀菌、UMTC杀菌后总酚含量分别提升了9.65%、7.36%，这可能是因为超声处理的提取效应引发的细胞内含物流出以及束缚态酚类物质的释放所引起[36]，微波处理和UMTC杀菌中的中温均相应地造成多酚损失，但最终还是较多的保留了多酚含量。

图2 不同杀菌方式对火龙果汁总黄酮和总酚含量的影响Fig.2 Effects of different sterilization methods on total flavonoids and total phenol content of Pitaya juice

2.5 火龙果汁抗氧化活性测定结果

由图3可知，4种抗氧化能力评价体系对不同杀菌方式处理后火龙果汁抗氧化能力的比较评估，在DPPH自由基清除率评价体系中，UMC杀菌自由基清除率最高，UMTC杀菌自由基清除率稍弱于鲜榨汁；在ABTS+自由基清除率体系中，UMC杀菌抗氧化能力显著优于另外2种杀菌方式，UMTC杀菌与鲜榨汁抗氧化能力差异不显著(P>0.05)，巴氏杀菌自由基清除率最低；在羟自由基清除率评价体系中，清除率强弱顺序为UMC杀菌(72.13%)>UMTC杀菌(71.28%)>鲜榨汁(63.92%)>巴氏杀菌(55.59%)；在超氧阴离子自由基清除率评价体系中，清除率强弱顺序为UMC杀菌(75.02%)>UMTC杀菌(67.95%)>鲜榨汁(42.82%)>巴氏杀菌(37.55%)；综合来看，抗氧化能力强弱顺序为UMC杀菌≥UMTC杀菌≥鲜榨汁≥巴氏杀菌，由图3也可看出总酚含量在不同杀菌方式下的变化趋势，与抗氧化能力强弱顺序相一致，表明总酚在抗氧化能力方面起到重要作用。巴氏杀菌清除率最低主要是因为高温作用使总酚含量显著下降所引起，UMC杀菌与UMTC杀菌自由基清除率较高是因为超声作用使得束缚态酚类物质释放使总酚含量上升，从而使清除率提高，另外，UMC杀菌中的微波处理会使火龙果汁组织基质发生改变，使细胞壁破坏，有助于结合性酚酸释放，导致抗氧化能力有所提高[37]。

图3 不同杀菌方式对火龙果汁抗氧化性的影响及总酚与抗氧化能力的关系Fig.3 The effect of different sterilization methods on the antioxidation of Pitaya juice and the relationship between total phenol and antioxidant capacity

2.6 火龙果汁感官评定

不同杀菌方式下火龙果汁的感官评价如图4所示，巴氏杀菌处理后的火龙果汁色泽、风味等整体分值偏低，有蒸煮的气味，组织状态较差，这可能是由于巴氏杀菌长时间的高温加热所致；UMC杀菌和UMTC杀菌后效果都较好，这是因为超声处理能较好的保留香气，另外会促进醇类、醛类物质转化为酯类物质，使香气更加浓郁，UMC杀菌中微波处理也会使一些风味物质溶出，如糖类、花色苷等，使火龙果汁风味更加突显。从综合评价可得感官总分顺序为鲜榨汁>UMC杀菌>UMTC杀菌>巴氏杀菌，所以UMC杀菌后可以较好的保持火龙果汁的品质。

图4 不同杀菌方式下火龙果汁的风味感官评估Fig.4 Sensory evaluation of flavor of Pitaya juice under different sterilization methods

3 结论

本实验对比了超声-微波联合杀菌(UMC杀菌)、超声-中温联合杀菌(UMTC杀菌)与巴氏杀菌对火龙果汁品质及抗氧化性的影响，火龙果汁经过这3种杀菌处理后均能达到GB 7101—2015国家标准，其中UMC杀菌效果最好，也能较好的保持火龙果汁的品质。3种杀菌方式对火龙果汁总酸、总糖、可溶性固形物含量均没有显著差异(P>0.05)，但Vc和花色苷含量有不同程度的下降，其中UMC杀菌有较好的保留效果，巴氏杀菌导致火龙果汁褐变最为严重，而UMC杀菌和UMTC杀菌能较好的保持火龙果汁色泽。另外，巴氏杀菌、UMC杀菌、UMTC杀菌处理对总黄酮含量有显著性影响(P<0.05)，而UMC杀菌和UMTC杀菌使总酚含量显著上升，所以抗氧化能力也有所提高。在火龙果汁感官评价中，UMC杀菌后的果汁色泽提升，口感与组织状态也较好，综合得出UMC杀菌能较好的保持火龙果汁的品质并提高抗氧化能力。