长链非编码RNA RP13-753N3.1通过促进CDKN1A基因的表达抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭

张 军,吴一凡,张茂娜,江 悦,张 弘*

(1武汉大学人民医院鄂州医院病理科,鄂州 436000;2三峡大学医学院形态学教研室;*通讯作者,E-mail:zmn0306@126.com)

膀胱癌是人类泌尿系统发生率最高的肿瘤,早期分子诊断和靶向治疗对膀胱癌未来的治疗发展尤其重要[1]。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码单链RNA,通过促进或抑制基因的表达,参与调控细胞包括肿瘤细胞在内的增殖、凋亡、衰老、分化、转移等一系列生物行为[2-5]。近年来不断有新的lncRNA被证实参与了膀胱癌的发生发展。RP13-753N3.1是近期新发现的一个lncRNA分子,但其在细胞中的作用尤其是在肿瘤细胞中的存在意义尚未明确。本研究通过检测RP13-753N3.1在膀胱癌组织中的表达,并以RP13-753N3.1表达量最低的膀胱癌细胞株为细胞模型,观察了RP13-753N3.1对膀胱癌增殖和侵袭的影响,初步探讨了RP13-753N3.1在膀胱癌细胞中的基因调控作用,有助于揭示RP13-753N3.1与膀胱癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞株及主要试剂

收集武汉大学人民医院鄂州医院泌尿外科膀胱癌组织和癌旁组织各16例。膀胱癌所有组织标本经病理科专家确定。所有患者术前均未进行放疗和化疗,本研究经过武汉大学人民医院鄂州医院伦理委员会批准,患者及家属均签署知情同意。阴性对照质粒和RP13-753N3.1质粒购自广州锐博生物科技有限公司;人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞株(5637、T24、BIU-87和J82)购自中国典型培养物保藏中心。qPCR试剂盒购于日本TaKaRa公司;DMEM培养基、RPMI-1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司;LipofectamineTM3000和Matrige基质胶购自美国Invitrogen公司;qPCR引物购自上海生物工程股份有限公司;GAPDH、CDKN1A、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白抗体购自英国Abcam公司(蛋白编号分别为ab8245、ab36839、ab76055、ab18203、ab53519和ab27568)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司。Transwell小室购自美国corning公司。

1.2 细胞培养和转染

膀胱癌细胞株(5637、T24、BIU-87和J82)采用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,培养条件为37 ℃、5%CO2。以对数生长期的J82细胞为转染对象,依据LipofectamineTM3000转染手册进行转染。实验随机分为阴性对照组(转染阴性质粒)和RP13-753N3.1组(转染RP13-753N3.1质粒)。转染后第48小时检测转染效率并进行后续实验。

1.3 qPCR检测组织或细胞中RP13-753N3.1和CDKN1A mRNA的表达

根据Trizol说明书提取组织或细胞总RNA,将吸光度在1.8-2.0的RNA样品逆转录为cDNA,以GAPDH为内参,qPCR检测组织或细胞中RP13-753N3.1和CDKN1A mRNA的表达。反应体系为25 μl,反应条件为96 ℃ 5 min、96 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,40个循环。Ct值采用2-ΔΔCt分析方法进行处理,观察组织或细胞中RP13-753N3.1和CDKN1A mRNA的表达差异。PCR引物见表1。

表1检测RP13-753N3.1和CDKN1AmRNA表达的qPCR引物序列

Table1TheqPCRprimersequencesfordetectingRP13-753N3.1andCDKN1AmRNAexpression

基因 Sequences(5′-3′) RP13-753N3.1上游:GAACCCAAGAGATCGGGATT下游:GTTGTTGTTAAGAGACAGGGTCACCDKN1A上游:CGATGGAACTTCGACTTTGTCA下游:GCACAAGGGTACAAGACAGTGGAPDH上游:CTGTGGGAGCGAATCGAGG下游:CAGCGCAAGATGTCCATCA

1.4 免疫组化检测膀胱癌组织中CDKN1A蛋白的表达

将膀胱癌组织和癌旁组织石蜡切片处理。脱蜡、水化后,采用0.3%过氧化氢孵育10 min。在PBS溶液中浸泡10 min,用血清工作液在室温孵育15 min。采用一抗稀释液(1 ∶100稀释)在4 ℃冰箱内过夜。在37 ℃下复温50 min后,用PBS溶液洗2次。加入二抗在室温下静置50 min。用PBS溶液洗2次后,DAB显色3 min,苏木精复染后,用盐酸乙醇分化,封片及镜检。观察膀胱癌组织和癌旁组织中CDKN1A蛋白的表达。CDKN1A蛋白阳性反应为棕色颗粒,以细胞质中出现棕色颗粒作为阳性表达。

1.5 Western blotting检测各组细胞CDKN1A及下游蛋白的表达

细胞转染后第48小时,收集两组细胞并提取蛋白,应用BCA法测两组蛋白样品浓度,以30 μg上样量计算两组上样体积,采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)并硝酸纤维膜转膜后,室温下采用5%脱脂牛奶封闭,分别与一抗CDK4(1 ∶1 000稀释)、CDK6(1 ∶1 000稀释)、Slug(1 ∶500稀释)和E-cadherin(1 ∶500稀释)在4 ℃摇床孵育过夜,与二抗在室温摇床孵育1.5 h,采用ECL化学发光试剂发光显影,比较两组蛋白表达差异。

1.6 MTT法检测两组细胞增殖能力

细胞转染后第48小时,制备细胞悬液并调整密度,按5×103个/孔接种到96孔板,每孔约150 μl,每组设置3个复孔。分别于第1,2,3,4,5天加入15 μl/孔MTT溶液,继续培养3 h后,弃上清,加入200 μl/孔二甲基亚砜,摇床振荡20 min使结晶溶解。酶标仪测定波长在450 nm处每孔的吸光度值。

1.7 Transwell侵袭实验检测两组细胞侵袭能力

细胞转染后第48小时,制备细胞悬液并采用无血清培养基调整密度,无血清培养基重悬细胞密度调整为1.5×105个/ml。将Matrige胶与无血清培养基按照1 ∶6稀释,将稀释后的Matrigel胶按照60 μl(0.2 μg/μl)加入Transwell小室,在培养箱内培养20 min,保证Matrigel胶凝固。将200 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室,下室加入500 μl完全培养基,放入培养箱培养24 h。采用甲醛固定20 min,0.1%结晶紫染液染色20 min,棉签擦去上室面细胞。显微镜下观察、拍照、计数(4个高倍视野下穿过上室面的细胞数取平均值)。

1.8 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行分析,计量资料均以均数±标准差表示,组间分析采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和癌旁组织中RP13-753N3.1的表达水平

与癌旁组织相比,膀胱癌组织中RP13-753N3.1低表达(P<0.01,见图1)。

2.2 人正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞株RP13-753N3.1的表达水平

与人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)相比,膀胱癌细胞株(5637、T24、BIU-87和J82)中RP13-753N3.1均呈现低表达(P<0.05),J82细胞中RP13-753N3.1表达水平最低(P<0.01,见图2)。

2.3 CDKN1A在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达

采用免疫组化法检测膀胱癌组织和癌旁组织中CDKN1A的表达,CDKN1A阳性结果表现为细胞核棕黄色颗粒(见图3),以细胞质中出现棕色颗粒作为阳性表达。与癌旁组织相比,CDKN1A在膀胱癌组织中的表达明显减少。

图1 膀胱癌组织和癌旁组织中RP13-753N3.1的表达水平Figure 1 Expression level of RP13-753N3.1 in bladder cancer tissues and adjacent tissues

与SV-HUC-1细胞相比,*P<0.05,**P<0.01图2 人正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞株中RP13-753N3.1的表达水平Figure 2 RP13-753N3.1 expression in human normal bladder epithelial cells and bladder cancer cell lines

2.4 检测RP13-753N3.1的转染效率及两组细胞中CDKN1A mRNA的表达

阴性对照组和RP13-753N3.1组J82细胞中RP13-753N3.1相对表达量分别为1.01± 0.06和15.21± 1.79(t=7.95,P<0.01)。阴性对照组和RP13-753N3.1组J82细胞中CDKN1A mRNA相对表达量分别为1.01± 0.07和6.51± 0.98(t=5.60,P<0.01,见图4)。与阴性对照组相比,RP13-753N3.1组细胞中CDKN1A mRNA的表达明显下降。

2.5 过表达RP13-753N3.1对CDKN1A蛋白及下游蛋白表达的影响

Western blotting结果显示,与阴性对照组相比,转染RP13-753N3.1后,CDK4、CDK6和Slug蛋白的表达水平明显降低,E-cadherin蛋白表达明显增加(见图5)。

图3 膀胱癌组织和癌旁组织中CDKN1A蛋白的表达Figure 3 Expression of CDKN1A protein in bladder cancer tissues and adjacent tissues

与阴性对照组相比,**P<0.01图4 qPCR检测RP13-753N3.1对CDKN1A mRNA表达的影响Figure 4 The effect of RP13-753N3.1 on CDKN1A mRNA expression detected by qPCR

图5 Western blotting检测RP13-753N3.1对CDKN1A及下游蛋白表达的影响Figure 5 Effect of RP13-753N3.1 on the CDKN1A protein and downstream target protein expression detected by Western blotting

2.6 过表达RP13-753N3.1对细胞增殖能力的影响

MTT检测结果显示,与阴性对照组相比,RP13-753N3.1组的细胞从4 d开始,增殖能力明显降低(P<0.05,见图6)。

与阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01图6 RP13-753N3.1对膀胱癌细胞J82增殖能力的影响Figure 6 Effect of RP13-753N3.1 on proliferation of bladder cancer cells J82

2.7 过表达RP13-753N3.1对细胞侵袭能力的影响

阴性对照组和RP13-753N3.1组J82细胞侵袭细胞计数分别为176.80± 12.78和98.28± 14.70(P<0.01,见图7)。与阴性对照组相比,转染RP13-753N3.1后的膀胱癌细胞侵袭能力明显被抑制。

3 讨论

近期研究表明,膀胱癌组织中存在众多异常表达的长链非编码RNA(lncRNA),参与调控膀胱癌细胞的一系列生物功能[6-9]。如LncRNA SPRY4-IT1在膀胱癌组织和细胞株中呈高表达,可通过富集miR-101-3p促进膀胱癌细胞的转移和增殖,且RP13-753N3.1的表达与膀胱癌患者的不良预后密切相关[10]。UCA1可通过调控miR-143/HMGB1信号通路,促进膀胱癌的侵袭和上皮间充质转化[11]。lncRNA CASC2在膀胱癌中表达明显降低,可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,显著降低膀胱癌细胞增殖和转移能力[12]。RP13-753N3.1是一种新发现的lncRNA,其在疾病特别是膀胱癌中的作用尚未明确。

与阴性对照组相比,**P<0.01图7 RP13-753N3.1对膀胱癌细胞J82侵袭能力的影响Figure 7 Effect of RP13-753N3.1 on invasion of breast cancer cells J82

本研究结果显示,膀胱癌组织和膀胱癌细胞株中RP13-753N3.1表达显著降低,表明RP13-753N3.1可能参与膀胱癌的发生发展,其过表达对膀胱癌细胞的生物学行为可能具有抑制作用。CDKN1A全称细胞周期依赖性激酶抑制剂1A,作为一种抑癌基因,CDKN1A在胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中均呈现低表达[13-15]。有研究表明,CDKN1A在膀胱癌中表达降低,可显著抑制膀胱癌细胞的增殖和转移[16]。本研究通过免疫组化实验发现,膀胱癌组织中CDKN1A蛋白的表达明显减少。过表达RP13-753N3.1的J82细胞中CDKN1A表达明显升高,说明RP13-753N3.1表达增加能上调CDKN1A表达。CDK4和CDK6是细胞周期相关蛋白,其表达增加是细胞增殖能力增强的重要标志[17]。上皮间充质转化又称EMT,是肿瘤细胞发生侵袭的主要分子机制,其中Slug蛋白是细胞的间质表型,E-cadherin蛋白是上皮表型,细胞在发生EMT过程会伴随上皮表型的丢失和间质表型的获得[18,19]。本研究结果表明,RP13-753N3.1诱导CDKN1A高表达后,CDK4、CDK6和Slug蛋白的表达明显降低,E-cadherin蛋白的表达明显增加,提示膀胱癌J82细胞的增殖和侵袭能力可能下降。MTT法和Transwell实验进一步表明,RP13-753N3.1的过表达可引起膀胱癌细胞的增殖能力和侵袭能力均明显降低。RP13-753N3.1如何调控CDKN1A基因的表达尚不明确,这也是本研究下一步研究的重点。

综上所述,RP13-753N3.1在膀胱癌中作为一种抑癌基因的形式存在,能明显抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭,其分子机制可能是通过促进CDKN1A的表达发挥作用。本研究为进一步研究RP13-753N3.1具体机制提供了理论基础,RP13-753N3.1有望成为膀胱癌诊治的潜在靶点。