美国国家家禽改良计划标准程序（2014版）—分子检查程序

译校│刘洋 付雯 翟新验（中国动物疫病预防控制中心）

1 鸡毒支原体和滑液囊支原体聚合酶链式反应（PCR）的推荐实验室程序

（a）DNA提取。通过非酚类程序从放置在磷酸缓冲盐溶液（PBS）中的气管拭子中取1毫升拭子液或1毫升肉汤培养物中提取DNA。以14000×g的速度对样品离心5～10分钟。弃去上清液并用1毫升PBS洗涤沉淀物。按上述方式离心，并将沉淀物重新悬浮在25～50微升的0.1%焦碳酸二乙酯（DEP）水中。100℃煮沸10分钟，然后4℃孵育10分钟。按上述方式离心，并将上清DNA转移至不含核酸酶的试管中。通过分光光度计在260纳米和280纳米处的读数估计DNA浓度和纯度。

（b）引物选择。

（1）鸡毒支原体。鸡毒支原体的引物序列如下：

MG-F5'GAGCTAATCTGTAAAGTTGG TC

MG-R5'GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC

（2）滑液囊支原体。滑液囊支原体的引物序列如下：

MS-F5'GAGAAGCAAAATAGTGATA TCA

MS-R5'CAGTCGTCTCCGAAGTTAA CAA

（c）聚合酶链式反应。

（1）用下列45微升聚合酶链式反应混合物之一处理每种样品（100～2000纳克/5微升）：（i）5微升×10×聚合酶链式反应缓冲液，1微升dNTP[10mM（M是mol/L的简写）]，1微升下游引物（50μM），1微升上游引物（50μM），4微升MgCl2（25mM），1微升Taq聚合酶（5U），32微升DEP水；（ii）18微升水，25微升PCR混合物（Promega），1微升下游引物（50μM），1微升上游引物（50μM）。

（2）在Perkin-Elmer9600热循环仪或HybaidPCRExpress热循环仪中进行DNA扩增。

（d）电泳。将聚合酶链式反应产物（5～10微升）与2微升加载缓冲液（Sigma）混合，加入到含有0.5微克/毫升溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中，在TAE缓冲液（40m Mtris；2mM EDTA；以冰醋酸调节酸碱度至8.0）中进行电泳，80伏条件下的30分钟。在紫外线透照下，可与聚合酶链式反应标记物（50～2000bp；Sigma）对照观察到鸡毒支原体（185bp）和滑液囊支原体（214bp）扩增产物。

（e）替代方法。只要使用第1部分子部分D中列出的MG和MSPCR引物，且遵循程序标准所述的能力测试达到官方国家机构和动植物卫生检查局满意的效果，表明实验室已经达到或优于其要求的聚合酶链式反应检测水平，则经认可的实验室可使用备选方法（设备和反应成分）。每次试验，都应采用动植物卫生检查局提供的血细胞凝集抗原作为定量的阳性对照。应按时间保持记录，以显示随着时间的推移，该试验中对照产物的产生及反应的一致性。

2 鸡毒支原体实时聚合酶链式反应的推荐实验室程序

（a）DNA提取。使用QiagenQIAamp小型试剂盒进行DNA提取或等效验证技术/程序。该试剂盒使用方法如下：100微升的拭子悬浮液与10微升蛋白酶K和400微升裂解缓冲液在56℃孵育10分钟。孵育后，将100微升100%乙醇加入到裂解物中。按照提取试剂盒要求进行洗涤和离心。

（b）引物选择。上游引物mglpU26（5'-CTAGAGGGTTGGACAGTT ATG-3'）位于鸡毒支原体R株基因组序列765566～765586位；下游引物mglp164（5'-GCTGCACTAAATGATA CGTCAAA-3'）位于鸡毒支原体R株基因组序列765448～765470位；Taqman双标记探针mglpprobe（5'-FAMCAGTCATTAACAACTTACCA CC AGAATCTG-BHQ1-3'）位于鸡毒支原体R株基因组序列765491～765520位。上述引物和探针用于扩增lp基因中一个139bp的片段。

（c）鸡毒支原体实时聚合酶链式反应。25微升反应体系包括：12.5微升的QuantitectProbe聚合酶链式反应2X混合物（加州瓦伦西亚Qiagen公司），引物的终浓度为0.5μM，探针的最终浓度为0.1μM，1微升的HKUNG不耐热尿嘧啶N-糖基化酶（威斯康星州麦迪逊Epicentre公司），2微升的水和5微升的模板。该反应可以在SmartCycler（加州森尼韦尔Cepheid公司）或其他经验证等效的实时热循环仪中进行，条件是50℃2分钟；95℃15分钟，光学设备关闭；94℃15秒，60℃60秒，重复40个循环，光学设备开启。

（d）阳性的确定。在每次鸡毒支原体实时聚合酶链式反应试验中，阈值循环数（CT值）被确定为反应荧光超过30个荧光单位的聚合酶链式反应循环数。所有测试样本，有记录CT值的MGLP反应被认为是阳性，没有记录CT值的MGLP反应则被认为是阴性。

（e）对照组。在进行鸡毒支原体实时聚合酶链式反应试验时，应设定适当的对照组。阳性、定量、提取和内部控制组可从北卡罗来纳州莫克斯维尔的GTCAllison公司购得。

（f）替代方法。只要使用MG聚合酶链式反应引物，且遵循程序标准所述的能力测试达到官方国家机构和动植物卫生检查局满意的效果，表明实验室已经达到或优于其要求的聚合酶链式反应检测水平，则经认可的实验室可使用备选方法（设备和反应成分）。

3 肠炎沙门菌普通聚合酶链式反应的推荐实验室程序

允许使用第二组引物用于实时聚合酶链式反应，这组引物的目标区域已经过肠炎沙门氏菌普通PCR检测验证。

（a）样品增菌。样品（拖曳拭子、小鸡纸拭子等）置于四硫酸盐增菌液中37℃或42.0℃增菌18～24小时，并按照本程序标准规定的步骤在改良半固体氯化镁孔雀绿（MSRV）增菌液中进行传代培养。

（b）质量控制。BHI肉汤培养的阳性对照，即已知的肠炎沙门氏菌或ATCC菌株应接种到微量半固体氯化镁孔雀绿培养基上，孵育18～24小时，并从初始接种部位外的白色沉淀物生长区获得1～3个胶块。从未接种的微量半固体氯化镁孔雀绿平皿区域收集阴性对照。

（c）DNA提取。在初始接种部位以外的迁移区域中取1～3个微量半固体氯化镁孔雀绿胶块（100微升），加入100微升PCR级别水中，煮沸10分钟提取DNA，或者采用其他DNA提取办法。样品在用于聚合酶链式反应前应先冷却至室温，如果不立即进行聚合酶链式反应应2～8℃下储存。对于煮沸法提取的样品，以16000×g离心3分钟。上清液中含有DNA。

（d）引物选择。肠炎沙门氏菌的特异性引物为：

sdfI（上游）-TGTGTTTTATCTG ATGCAAGAGG

sdfI（下游）-CGTTCTTCTGGTA CTTACATGAC。

内部对照的引物为：

rplI（上游）-GGGTGATCAGGT TAACGTTAAAG

rplI（下游）-CTTCGTGTTCGCC AGTGGTACGC。

（e）聚合酶链式反应。应在干净的环境中，配制多重PCR反应液于200微升PCR管或25微升PCR管（每个反应管含两组引物），见表1。

表1 反应混合物的体积及浓度

（f）聚合酶链式反应扩增程序（见表2）。

表2 PCR扩增程序

（g）电泳。聚合酶链式反应完成后，应通过DNA电泳分析样品。推荐在1.5微升上样缓冲液中加入3.5微升样品，在3%RAGE凝胶，或1%～3%的常规凝胶中进行电泳。Sdfl引物仅在肠炎沙门氏菌DNA存在下产生293bp条带，rplI引物将在任何细菌DNA存在下产生343bp条带（迄今为止引物可与除奇异变形杆菌外的所有微生物一起使用）。

参考文献：CharltonBR,Walk erRL,KindeH,BauerCR,Channing-SantiagoSE,etal.(2005)Comparisono faSalmonellaEnteritidis-SpecificPo lymeraseChainReactionAssaytoDela yedSecondaryEnrichmentCulturefor theDetectionofSalmonellaEnteritidis inEnvironmentalDragSwabSamples.AvianDiseases:Vol.49,No.3pp.418-422.

或者在基于SYBR的实时聚合酶链式反应试验中，也可使用以下引物：

F2TTGATGTGGTTGGTTCGTCACT,

R2TCCCTGAATCTGAGAAAGAAAAACTC

（h）替代方法（设备和反应成分）。只要使用本子部分所列的适当的聚合酶链式反应引物，且运用本方法通过了动植物卫生检查局规定的D群沙门氏菌检测能力检验，表明实验室已经达到或优于其要求的聚合酶链式反应检测水平，则经认可的实验室可使用备选方法如果使用实时聚合酶链式反应试验，每次试验都应包含采用已知肠炎沙门氏菌菌株（经NVSL确证）制成的定量阳性对照，或使用通过QiagenDNeasyTissueKit（货号69506号或等效产品）提取的ATCC菌株。应按时间保持记录，以显示随着时间的推移，该试验中对照产物的产生及反应的一致性符合官方国家机构的要求。

4 沙门氏菌D血清群实时聚合酶链式反应的推荐实验室程序

（a）样品增菌。样品（拖曳拭子、小鸡纸拭子等）置于四硫酸盐增菌液中37℃或42.0℃增菌24小时，并在改良半固体氯化镁孔雀绿（MSRV）增菌液中进行传代培养。

（b）质量控制。BHI肉汤培养的阳性对照，即已知的肠炎沙门氏菌或ATCC菌株应接种到微量半固体氯化镁孔雀绿培养基上，孵育18～24小时，并从初始接种部位外的白色沉淀物生长区获得1～3个胶块。从未接种的微量半固体氯化镁孔雀绿平皿区域收集阴性对照。

（c）DNA提取。在初始接种部位以外的迁移区域中取1～3个微量半固体氯化镁孔雀绿胶块（100微升），加入100微升聚合酶链式反应级别水中，煮沸10分钟提取DNA，或者采用其他DNA提取办法。样品在用于聚合酶链式反应前应先冷却至室温，如果不立即进行聚合酶链式反应，应2～8℃下储存。对于煮沸法提取的样品，以16000×g离心3分钟。上清液中含有DNA。

（d）引物和探针选择：

sefAR（上游）：22bp序列5'GGCTTCGGTATCTGGTGGTGTA3（50nM终浓度）；（例如：如果引物储存浓度为10μM，则使用更小体积）。

sefAR（下游）：24bp序列5'GGTCATTAATATTGGCCCTGAATA3（900nM终浓度）；（例如：如果引物储存浓度为10μM，则使用更小体积）。

sefAPR（探针）：25bp序列

5'FAM/CCACTGTCCCGTTCGT TGATGGACA/TAMRA或类似的猝灭基团（250nM浓度）。

（e）聚合酶链式反应。应在干净的环境中完成实时PCR反应（或其他类似反应）。配制反应液时应使用防止气溶胶产生的移液器吸头，以减少污染的可能性。反应的总体积为50微升（Opticon）或25微升（SmartCycler），见表3。

（f）聚合酶链式反应扩增程序，见表4。

（g）结果分析。CT值小于35的样品为阳性。CT值介于35和40之间的样品为疑似。阳性和疑似样品需通过培养的方法进行进一步验证。

5 制备能力检验样本盘，并用于建立实验室间的等效方法的推荐实验室程序，该方法用于家禽上呼吸道样本进行疾病分子鉴定

表4 PCR扩增程序

希望与官方国家机构合作的任一州的参与者均可使用以下方法建立实验室间的能力验证样品盘，以建立一种定量的方法来确保用于分子检测的方法与在给定区域提供服务的实验室具有相似的检测水平，并与检查局提供的用于《美国国家家禽改良计划》当前所用抗原具有一定的关联性。

（a）可从爱荷华州埃姆斯的国家兽医服务实验室订购一批新的所需抗原［鸡毒支原体红细胞凝集（HA）试剂编号100，滑液囊支原体（HA）试剂编号120，火鸡支原体（HA）抗原试剂编号110］。支原体红细胞凝集抗原应在收到后解冻，并立即以250微升体积分装，并在适当鉴定后于-70℃冰箱中重新冷冻。在使用这些红细胞凝集抗原时，请记住它们是活的生物体，并因其含有较高浓度的目标DNA而可以传播疾病。应使用适当的实验室生物安全措施。

（b）样品生产时，进入一个“不含NPIP疾病”的鸡群并收集75个拭子（实验室使用的正常类型，但最好是单独包装在试管或塑料包中的带塑料柄的人造丝棉签），从鸟腭裂区（腭裂）轻轻转动收集黏液和细胞。要避免拭子沾上血，因为这可能会导致本程序中的某些试验出现错误反应（特别是禽流感ACIA检测）。这些拭子现在将被称为“CP”拭子。此过程中无须使用目标动物；其目的是收集背景家禽细胞和伴生的呼吸道微生物。

表3 反应混合物的体积及浓度

（c）接下来，在测试“液”中添加一份磷酸缓冲盐溶液或载有抗原的拭子和四个“仅禽类”拭子，制成含有五个拭子的测试液集。它们将被保存在单独的包装中，但用一个小袋子或橡皮筋连在一起。如果要进行能力测试，需追踪拭子的磷酸缓冲盐溶液（阴性对照）或抗原浓度标识以及测试液的代码。避免在含有磷酸缓冲盐溶液或抗原的单个拭子上留下临时标记。

（d）将所有测试液样品盘进行包装，冰箱储存过夜并通过次日送达快递服务寄出，以便次日进行DNA提取和聚合酶链式反应分析。

（e）建议在任何大型项目之前，用抗原和最小化的样品盘进行小量测试，以缩小所需的稀释度范围。（如果上述推荐的水平不能在你和其他实验室的系统中达到预期的目标，可能就需要对其进行调整。这也是评估不同拭子类型的一个好方法；使用同一类型的拭子也有可能产生差异。如果您尝试使用后就会发现，普通棉拭子实际上并不可取。）

（f）在实验室中完成正常的提取和聚合酶链式反应/分子方法。（开始能力测试前，先弄清楚实验室是否需要不同大小的样品盘，还是根本不需要样品盘。）

6 运用即时反转录聚合酶链式反应检测水禽中的禽流感

当AmbionMagMAX（LifeTechnologies公司产品，货号AMI835）磁珠提取试剂盒用于《美国国家家禽改良计划》NAIUSH5/H7禽流感净化和USH5/H7禽流感监测计划时，《美国国家家禽改良计划》认可采用家鸭和家禽的泄殖腔拭子作为rRT-PCR检测的样本。rRT-PCR程序将继续用于筛选检测，所有阳性结果需要进一步测试。