华法令和低分子肝素对狼疮抗凝物检测的干扰研究

靳 岩，张凤华，曹盛吉，王筱雨，袁晓阳

(大连医科大学附属第一医院检验科,辽宁大连 116011)

狼疮抗凝物(LA)是抗磷脂抗体的一种，LA的持续存在常见于抗磷脂综合征，主要表现为血栓和反复流产[1]，有非常广泛的产科风险[2]。LA检测受到多种因素干扰，抗凝药物是其中之一。本文探讨口服华法令和肌肉注射低分子肝素(LMWH)对LA检测的干扰。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年2-9月本院门诊及病房心脏机械瓣膜置换术后口服华法令患者80例，其中男48例，女32例，年龄35～83岁，平均(68.8±21.5)岁；肾病透析肌肉注射LMWH患者80例，男43例，女37例，年龄16～85岁，平均(64.5±16.2)岁。

表1 各组LA情况

*：P<0.01，与对照组比较

表2 口服华法令LA比值假阳性患者混合试验情况

*：P<0.01，△:P>0.05,与对照组比较

排除抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、结蹄组织病等引起LA阳性患者。按国际标准化比值(INR)和LMWH抗Ⅹa活性分组：口服华法令分为INR≤1.5、>1.5～2.0、>2.0～2.5、>2.5，肌肉注射LMWH分为抗Ⅹa活性(IU/mL)≤0.5、>0.5～1.0、>1.0～1.5、>1.5，每组20例。对照组为健康体检者(问卷调查和化验结果、体检报告结果表观正常)，男13例，女7例，年龄40～68岁，平均(62.6±13.1)岁。本研究经伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2方法 所有研究对象109 mmol/L 枸橼酸钠抗凝血2 000 r/min离心15 min，口服华法令患者采用凝固法在cs-5100血凝仪上检测凝血酶原时间(PT)并换算成INR，肌肉注射LMWH患者采用发色底物法在ACL TOP 700血凝仪上检测LMWH抗Ⅹa活性。检测后取出血浆再次离心去除血小板(低于10×109/L)后放入EP管中-40 ℃冰冻保存，待样本收集完全，37 ℃速溶后统一检测LA。LA用改良蝰蛇毒磷脂时间(DRVVT)法在CS-5100血凝仪上检测筛选试验时间(正常值31～44 s)和确证试验时间(正常值30～38 s)，结果用比值表示(>1.2为阳性)[3]。试剂及质控品为原厂配套试剂。从口服华法令组LA比值假阳性样本中随机选取20例，用健康人混合血浆1∶1稀释做混合试验，重新检测上述指标，混合血浆凝血因子接近100%,血小板计数小于10×109/L。

2 结 果

口服华法令、肌肉注射LMWH各组筛选、确证试验时间均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，且随着INR、LMWH抗Ⅹa活性增加，筛选、确证试验时间值及LA比值、LA比值假阳性率呈上升趋势，见表1。混合试验中，口服华法令组筛选、确证试验时间均高于对照组(P<0.01)，LA比值差异无统计学意义(P>0.05)，LA比值假阳性率均为0，见表2。

3 讨 论

2009年国际血栓和止血协会(ISTH)建议对抗磷脂综合征患者进行LA检测，推荐DRVVT作为LA检测首选方法[4]，包括筛选试验和确证试验。在LA筛选试验中，鲁赛尔氏蝰蛇毒直接激活Ⅹ因子使血浆凝固。存在LA能使LA1筛选试剂的凝固时间延长，LA2确证试剂和LA1筛选试剂一样，但含高浓度磷脂，外源性磷脂与LA抗体结合，很大程度上纠正了凝固时间。华法令使维生素K依赖凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成减少，凝血酶原时间延长，从而达到抗凝血作用，世界卫生组织(WHO)要求采用INR统一判断治疗效果。口服华法令患者Ⅹ因子减少是引起LA假阳性的重要原因，华法令导致凝血时间延长与LA导致凝血时间延长叠加增加了LA检测难度[5]。ISTH 2009 LA诊断指南推荐患者停药1～2周或INR<1.5时再行检测[6]，当INR>1.5时用1∶1混合试验。本研究发现即使INR<1.5，也会有LA比值假阳性，并且会使筛选试验时间和确证试验时间延长，与此指南有差异。而英国血液学标准化委员会(BCSH)2012 LA诊断指南[7]删除了当INR<1.5时直接检测LA这一项，可能也发现了这个问题，推荐口服华法令做混合试验和大班蛇毒凝固时间法(TSVT)+蛇静脉酶时间(ET)检测LA。TSVT+ET目前国内很难展开，1∶1混合试验简单可行，即健康人混合血浆(至少20例)和患者血浆1∶1混合后检测LA，主要可排除凝血因子缺乏的影响。混合血浆补充了患者缺乏的Ⅹ因子，使凝血时间正常，LA比值正常。能纠正由华法令引起的假阳性，与本试验结果相吻合。但因为稀释效应可导致1∶1混合试验出现假阴性[8]，本试验口服华法令LA假阳性患者混合试验的筛选、确证试验时间较健康者延长(P<0.01)可以证明这一点，尽管筛选、确证试验时间都在正常范围内。混合试验阴性不能完全排除LA存在。

DRVVT试验的试剂中存在抗肝素剂，试剂说明书中明确规定当肝素水平达到1 U/UL时，对结果没有影响，因LA筛选试剂和LA2确证试剂中含中和试剂，可能针对的是小剂量的普通肝素而对LMWH无效，其原因是LMWH主要含抗Ⅹa，LMWH抗Ⅹa活性检测是专家推荐的监测LMWH抗凝效果的方法[9]。而DRVVT蝰蛇毒直接激活Ⅹ因子，因而使用LMWH会出现LA比值假阳性。有报道接受LMWH治疗的患者血浆抗Ⅹa活性能够被检出，但水平仍然很低[10]。本研究发现即使血浆中LMWH抗Ⅹa活性不高也能使筛选、确证试验时间延长，出现LA比值的假阳性。

LA阳性大多伴血栓，而血栓患者大多服抗凝药物，调查显示1/3患者在进行LA检测时已经进行抗凝治疗[11]。实验室与临床应建立及时有效的沟通程序，减少分析前干扰因素对结果解释的影响[12]。应在报告阳性结果时审查患者当前治疗药物，间隔12周重新检测，LA持续阳性与血栓风险更相关。