1,25-二羟基维生素D3对脂肪细胞脂滴代谢的影响

向 薇，程 实，马 玲

(1.新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐 830011；2.西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，四川泸州 646000)

肥胖是全世界范围内重要的公共卫生问题[1]，从细胞层面看，肥胖发生的原因在于脂肪细胞体积肥大和增生所造成，而这些现象的主要原因之一就是细胞内脂肪过度的堆积[2]，其在形态上主要表现为中央超大脂滴的形成。细胞形态的改变，脂滴作为脂肪细胞内一种特殊的细胞器，在调节细胞内脂质代谢过程中起到关键作用，其过度的膨大将会导致生物体脂质代谢紊乱[3]，是胰岛素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病等疾病的重要特征之一[4]。

1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]在骨骼中的作用早已被大量且深入的研究，而近些年，越来越多的证据表明1,25(OH)2D3的缺乏是肥胖的独立危险因素[5]。细胞研究也发现1,25(OH)2D3可在体外培养的脂肪细胞中起到调节脂肪代谢的作用，并明显抑制脂肪生成，减少细胞内脂肪含量[2]。虽然1,25(OH)2D3对脂肪细胞脂质代谢的研究已有很多，但结果并不一致，且其对脂肪细胞脂滴融合能力影响的研究还未见报道。本研究观察其对细胞脂滴形态和脂肪细胞脂滴融合相关基因的影响，为其有效地防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 3T3-L1细胞系购自美国ATCC公司，用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5%CO2的无菌培养箱中进行细胞培养，每隔2 d更换1次培养基。当细胞生长至80%～90%时进行传代。

1.1.2主要试剂及仪器 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、1,25(OH)2D3(美国Sigma公司),胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，上海生工生物工程股份有限公司)，棕榈酸(PA，北京Solarbio公司)，牛血清白蛋白(BSA，德国Biofroxx公司)，油红O、BCA法蛋白检测试剂盒、三酰甘油(TG)试剂盒(南京建成生物技术研究所)；RNAiso Plus和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (日本TAKARA公司)，cDNA反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，酶标仪(美国BIO-RAD公司)，CO2培养箱、离心机、超净工作台、PCR仪(美国Thermo公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，水浴锅(北京永光明医疗仪器有限公司)，电子天平(上海天美天平仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1诱导液的配置 诱导液Ⅰ，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中加入0.5 mmol/L的IBMX、10 μg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米。诱导液Ⅱ，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中加入10 μg/mL胰岛素。

1.2.2不同浓度PA溶液 取30% BSA溶液，置于55 ℃水浴中30 min；将PA置于0.01 mol/L的NaOH溶液中配成10 mmol/L的PA储存液，于70 ℃水浴中30 min，在70 ℃条件下分别取330 μL的30% BSA溶液迅速与100、300、600、900 μL PA储存液混合振荡，用10%FBS高糖DMEM定容于10 mL，于超净台中过滤，分别得到100、300、600、900 μmol/L的PA培养液，现用现配。

1.2.3诱导分化 采用“鸡尾酒法”，将细胞以每毫升2×105个接种于6孔板中，待细胞接触抑制48 h后，将细胞培养基换为诱导液Ⅰ(计为分化第0天)，每2天换1次液。4 d后换诱导液Ⅱ，每2天换1次液。至分化第8天时，90%以上细胞分化为成熟脂肪细胞。

1.2.4肥大脂肪细胞模型的建立 将细胞以每毫升2×104个接种于96孔板中，当细胞接触抑制后按上述方法进行诱导分化，待3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞后，分别用0、100、300、600、900 μmol/L的PA培养液干预24 h后，进行MTT细胞活力检测。同样将细胞以每毫升2×105个接种于6孔板中，待细胞分化为成熟脂肪细胞后，用不同浓度的PA培养液干预24 h后，测细胞质TG，根据试剂盒说明书进行。筛选出最佳干预浓度。

1.2.5不同浓度1,25(OH)2D3干预 将正常培养的3T3-L1细胞按照每毫升2×105个接种于6孔板中，当细胞接触抑制48 h后进行诱导分化。待细胞分化为成熟脂肪细胞后，根据筛选出的最佳PA浓度进行造模，造模24 h后分别用1、10、100 nmol/L的1,25(OH)2D3对模型细胞干预24 h，并设置分化成熟的脂肪细胞为对照组，PA干预的为模型组，以及3个不同浓度的干预组。

表1 引物设计和合成

PPAR:过氧化物酶体增殖物激活受体；CIDE:细胞死亡诱导DFF45样效应物

1.2.6油红染色 按照上述方法诱导分化8 d后，将培养基吸出，每孔加1 mL的PBS冲洗2次，每孔加1 mL的4%多聚甲醛固定15～20 min。弃去多聚甲醛，PBS冲洗后，加入油红染色15 min，吸出染剂后加入PBS润洗，于倒置显微镜下观察各组脂滴形成情况。

1.2.7脂滴数量和平均直径 采用Image-pro plus 6.0计算干预后各组脂滴数量和平均直径。

1.2.8TG水平 检测干预后各组TG水平。

1.2.9RT-qPCR 提取RNA，反转录成cDNA，稀释5倍后，RT-qPCR检测PPAR-α、PPAR-γ、CIDE-a、CIDE-c、UCP-1、PLIN-1 mRNA表达情况。PCR的反应条件为：95 ℃ 30 s，预热；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。上下游引物见表1。

1.3统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件进行分析。对实验所得计量数据进行正态性检验，方差齐者多组间直接用单因素ANOVA分析组间整体差异，如有差异则用Tukey法进行两两比较;方差不齐者用Brown-Forsythe对单因素ANOVA结果进行校正，如果有差异则用Games-Howell法进行两两比较。如果数据不符合正态性，则用非参数的秩和检验进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1筛选最佳PA浓度 MTT检测结果表明，600 μmol/L和900 μmol/L PA可使分化后的3T3-L1细胞活力下降，差异有统计学意义(P<0.05)，不作为最佳造模浓度。剩余组别中300 μmol/L组细胞TG水平最高，差异有统计学意义(P<0.05)，本研究最终选用300 μmol/L PA浓度作为造模最佳浓度，见图1。

A:各浓度PA干预后细胞活力；B:各浓度PA干预后TG水平；*：P<0.05，与对照组相比

图1筛选最佳PA浓度造模

A:各组TG水平；B:各组脂滴数量；C:各组脂滴平均直径；*P<0.05，与模型组比较

图2不同浓度1,25(OH)2D3对细胞脂滴的影响

A：对照组；B：模型组；C：1 nmol/L组；D：10 nmol/L组；E：100 nmol/L组

图3各组细胞油红染色(×200)

A：PPAR-α；B:PPAR-γ；C：CIDE-a；D：CIDE-c；E：PLIN-1；F：UCP-1；*：P<0.05，与模型组比较

图4各组细胞脂滴代谢相关基因mRNA表达情况

2.2脂滴直径和计数 用不同浓度1,25(OH)2D3干预模型细胞后油红O染色结果显示，模型组脂滴数量明显多于对照组(P<0.05),脂滴平均直径大于对照组(P<0.05)；与模型组相比，1 nmol/L组无论是脂滴数量还是平均直径差异均无统计学意义(P>0.05)，10、100 nmol/L组脂滴数量明显增加，脂滴平均直径明显减小(P<0.05)；模型组TG水平明显高于对照组(P<0.05)，而10、100 nmol/L组TG水平明显低于模型组(P<0.05)，见图2、3。

2.3脂滴相关基因mRNA表达情况 模型组PPAR-α mRNA表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；1,25(OH)2D3干预24 h后，高、中、低3个浓度组的PPAR-α mRNA表达均明显高于模型组(P<0.05)。PPAR-γ mRNA表达各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组CIDE-a mRNA表达明显高于对照组(P<0.05)，而1 nmol/L组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，10、100 nmol/L组CIDE-a mRNA表达明显低于模型组(P<0.05)。CIDE-c mRNA表达在对照组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，1,25(OH)2D3干预后的各浓度组均明显低于模型组(P<0.05)。UCP-1 mRNA表达只在100 nmol/L组与模型组差异有统计学意义(P<0.05)。PLIN-1 mRNA表达在对照组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，10、100 nmol/L组与模型组差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

3 讨 论

脂滴是一个动态的细胞器，其核心主要是由TG和胆固醇酯构成，在表面由单层磷脂包围，脂滴作为储存能量和代谢脂肪酸及固醇的细胞器，负责大量膜结构和激素的合成。脂滴在不同的细胞中有不同的表面蛋白，它们调节着脂滴的结构和功能，其中包括PPAR家族、CIDE家族、PAT家族等。

本研究中采用300 μmol/L PA对诱导分化8 d的3T3-L1细胞进行肥大效果的模拟，虽然通过油红染色观察到细胞内形成了大量脂滴，但无论是分化后的对照组还是模型组，都没有观察到脂肪细胞典型的中央大脂滴出现。在其他学者对3T3-L1细胞成脂分化的研究中，分化后油红染色拍照的放大倍数一般在40倍甚至更小，不能观察出细胞内脂滴的形态[6-7]，而BOSCHI 等[8]用与本文相同的方法对3T3-L1细胞进行成脂诱导分化，8 d后油红染色，显微放大倍数400倍的结果中并未发现中央大脂滴，对此疑问可能还需进一步研究探讨，体外研究用于诱导细胞成脂的方法可能还不够完善。通过软件对显微照片中脂滴量化后，模型组脂滴无论从数量还是平均直径上相较对照组均明显增加。1,25(OH)2D3对模型细胞进行干预后，10、100 nmol/L组脂滴平均直径相比于模型组明显降低。而对于1 nmol/L浓度的1,25(OH)2D3从油红染色的照片中并未观察到与模型组脂滴明显的形态变化。

PPARs在脂质代谢过程中的作用已经开展了大量研究[9]，其中PPAR-α是调节能量代谢和脂质氧化的关键因素，在脂类代谢调节中起着枢纽作用；而PPAR-γ是脂肪细胞分化和脂肪细胞因子表达的主要调节剂，参与脂肪细胞分化和糖脂代谢的调节[10]。除PPARs近几年有关脂质合成代谢的研究发现CIDE是重要的调节蛋白，CIDE-a和CIDE-c在脂肪细胞脂滴代谢的调控中都有重要作用[11]。同时，PAT家族中PLIN-1在脂肪细胞中高度表达，并调节脂质的分解过程。本研究中，10、100 nmol/L组的PPAR-α和PLIN-1 mRNA表达明显高于模型组，而CIDE-a和CIDE-c mRNA表达相比模型组明显下降，提示10、100 nmol/L浓度1,25(OH)2D3干预可以在一定程度上抑制PA对分化后3T3-L1细胞造成的脂肪堆积作用，抑制脂滴融合，与CHANG等[2]研究中产生促进脂肪分解效果的剂量相同。该研究只在100 nmol/L组UCP-1 mRNA表达与模型组有统计学差异，提示100 nmol/L浓度1,25(OH)2D3能增加空热产生，促进脂代谢。虽然 1 nmol/L组与模型组相比脂滴变化差异无统计学意义(P>0.05)，但PPAR-α mRNA表达相比模型组明显升高，CIDE-c mRNA表达明显下降，提示1 nmol/L浓度的1,25(OH)2D3浓度太低，在24 h的干预时间内还不足以对细胞脂滴的生物代谢产生明显的变化。而在JI等[12]研究中发现1 nmol/L的1,25(OH)2D3就可产生明显的效果，但还未见有用1 nmol/L浓度1,25(OH)2D3干预成脂分化后3T3-L1细胞的报道。1,25(OH)2D3干预后，尤其是10、100 nmol/L浓度，包括CIDE-a、CIDE-c、PLIN-1等均出现明显的变化，提示其可能抑制了脂质在细胞内的堆积。PPAR-γ是调节脂肪细胞脂质代谢的主要因子，主要表达在脂肪组织中，用于调节脂肪细胞的活动，脂质的代谢，应答胰岛素信号，并且与炎症相关[10]，但PPAR-γ mRNA表达在所有组之间差异均无统计学意义(P>0.05)，与CHANG等[2]的研究结果不一致。而BOLSONI-LOPES等[13]用200 μmol/L的棕榈油酸干预成脂分化后的3T3-L1细胞，发现棕榈油酸可以增加脂肪细胞脂质的分解，并且此过程依赖于PPAR-α的激活，而非PPAR-γ。

综上所述，本研究发现1,25(OH)2D3可以抑制PA造成的成脂分化后3T3-L1细胞的脂质堆积，10、100 nmol/L浓度效果较为明显，脂滴体积变小，数目变多，脂滴融合受抑制，脂肪降解的速度加快，导致脂肪细胞储存脂肪的能力降低。1,25(OH)2D3可能通过激活PPAR-α来起到抑制脂肪堆积的效果，而PPAR-γ可能并不参与其中。