染料木黄酮通过ERK及JNK通路抑制人非小细胞肺癌PC14细胞增殖

姜雪梅，钱越，戴红良

（锦州医科大学 1. 附属第一医院消化科； 2. 附属第一医院变态反应与临床免疫研究中心； 3. 护理学院社区护理学教研室，辽宁 锦州 121001）

肺癌在我国发病率极高。据统计，我国每年约有52万肺癌新发病例出现，死亡率为45万/年。其中，超过80%的晚期肺癌属于非小细胞肺癌［1］。尽管过去的20年间，人们对于肺癌有了更加充分的理解，但肺癌患者的5年生存率仍然很低［2］。染料木黄酮是大豆中重要的植物化学物，具有较强的酪氨酸激酶抑制活性［3-4］。近年来，染料木黄酮的抗癌作用备受关注。研究显示，染料木黄酮可抑制结肠直肠癌［5］、肝癌［6］、乳腺癌［7］及口腔癌［3］等多种癌细胞的增殖。也有研究［8-9］显示，染料木黄酮对肺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。本研究拟观察染料木黄酮对非小细胞肺癌PC14细胞增殖的影响，并对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

染料木黄酮 （纯度99.1%，中国药品生物制品检定所），DMEM培养基和胎牛血清 （美国Thermo Fisher Scientific公司），二甲基亚砜、噻唑蓝、结晶紫、PD98059、SB203580、SP600125 （美国Sigma公司），p-ERK抗体 （沈阳万类生物科技有限公司），JNK，p-JNK和ERK抗体 （美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记二抗 （美国Santa Cruz公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），倒置显微镜 （德国LEICA公司），洁净工作台 （青岛海尔生物医疗股份有限公司），酶标仪 （美国Thermo Fisher Scientific公司），电泳仪及转膜仪 （美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人非小细胞肺癌PC14细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37 ℃，5% CO2饱和湿度条件下进行培养。0.25% EDTA胰酶消化传代，待细胞处于对数生长期时进行实验处理。

1.2.2 细胞增殖检测：将对数生长期的PC14细胞接种于96孔板，培养过夜，每孔分别加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黄酮继续培养24、48、72 h。药物作用结束后，每孔加入5 g/L的MTT，继续培养4 h，随后以150 µL DMSO充分溶解甲臜后，在570 nm波长处测定每孔吸光度值。

1.2.3 细胞集落形成实验：将PC14细胞接种于6孔培养板中，每孔600个细胞，培养过夜后，每孔加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黄酮继续培养10 d，随后弃去培养液并用PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛固定后结晶紫染色并拍照。

1.2.4 蛋白提取和免疫印迹：收集细胞，加入含0.1% PMSF的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。蛋白经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至聚偏氟乙烯膜。以新鲜配置1% BSA室温下封闭1 h，TBST洗膜后，加入用TBST稀释的一抗4 ℃孵育过夜。用TBS-T充分洗去非特异结合的抗体后，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h。TBS-T充分洗涤后，ECL显色后经凝胶成像仪成像分析。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 染料木黄酮对PC14细胞增殖的影响

不同浓度染料木黄酮处理PC14细胞24、48和72 h后，细胞增殖随着药物浓度的增加和时间的延长，呈现出明显的下降趋势；集落形成实验也显示，染料木黄酮可剂量依赖性地抑制PC14细胞集落的形成，见表1，图1。

2.2 MAPK抑制剂对PC14细胞增殖的影响

表1 染料木黄酮对PC14细胞生长的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

表1 染料木黄酮对PC14细胞生长的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

1） P < 0.05 vs control group at the same time point.

Optical density 24 h 48 h 72 h Control 0.21±0.02 0.36±0.03 0.47±0.02 Genistein 2.5 mg/L 0.22±0.03 0.36±0.02 0.46±0.05 Genistein 5 mg/L 0.22±0.01 0.37±0.02 0.33±0.051）Genistein 10 mg/L 0.20±0.02 0.35±0.03 0.21±0.041）Genistein 20 mg/L 0.22±0.03 0.26±0.031） 0.11±0.021）Group

ERK特异性阻断剂PD98059、p38MAPK特异性阻断剂SB203580及JNK特异性阻断剂SP600125可使对照组MTT吸光度值由0.49分别下降至0.36、0.28及0.22。表明这3个MAPK分子在PC14细胞中均起到促进增殖的作用。

2.3 染料木黄酮对PC14细胞MAPK信号通路的影响

PC14细胞经不同浓度染料木黄酮处理后，p-p38MAPK蛋白的表达不受药物影响，而p-ERK及p-JNK的水平均随着药物浓度的增加而逐渐减弱，见图2。

3 讨论

图1 染料木黄酮对PC14细胞增殖的影响Fig.1 Effects of genistein on PC14 cell proliferation

图2 染料木黄酮对PC14细胞ERK及JNK通路的影响Fig.2 Effect of genistein on the ERK and JNK pathways in PC14 cells

近年来，天然物质高效低毒的特性受到药物研究人员的广泛关注。染料木黄酮是存在于大豆等植物中的天然异黄酮类非营养物质。研究［3-4］证实，该物质具有抑制平滑肌源性泡沫细胞的形成、抑制星形胶质细胞水肿及抗肿瘤等多种生物活性。研究［3］显示，染料木黄酮对多种肿瘤细胞的生长均显示出强大的抑制作用，而其对非小细胞肺癌作用和机制的研究尚处于初步阶段。本研究证实，染料木黄酮能显著抑制非小细胞肺癌PC14细胞的增殖，这与凌艺辉等［10］（H1299细胞） 及崔俊英等［11］（H1975） 报道的结果类似。同时，相较口腔癌TCA8113细胞，PC14细胞对染料木黄酮似乎更为敏感，2.5 mg/L的染料木黄酮即可显著降低肺癌细胞增殖［3］。

MAPKs属丝/苏氨酸蛋白激酶家族，主要包括ERK、JNK和p38MAPK 3个家族成员，在调节细胞增殖、分化、迁移、侵袭、炎症、死亡等多种生物学过程中都起着极为重要的作用［12］。但随着细胞类型、刺激条件、刺激时程等的不同，MAPKs家族既可以诱导细胞的增殖，又可能导致其死亡［12-13］。本研究发现，MAPKs特异性抑制剂可显著抑制PC14细胞的增殖，表明MAPKs分子的活化对于PC14细胞的增殖是不可或缺的。与此同时，本研究还证实染料木黄酮可显著抑制ERK及JNK的活化。基于上述结果，染料木黄酮对PC14细胞的增殖抑制活性与其对ERK及JNK的抑制有关。

肺癌在世界范围内发病率和死亡率都很高，临床上的治疗手段目前主要有手术、放疗和化疗等，但目前的化疗药物一般不良反应都较大，且其疗效有限［14-15］。因此，开发新型高效低毒的抗肺癌药物仍然是摆在药物工作者面前的一项重任。本研究证实，染料木黄酮可通过调控ERK和JNK的活化抑制肺癌细胞的增殖，染料木黄酮属于天然活性化合物，与传统化疗药物相比，其疗效确切、来源广泛、价格低廉、不良反应小，有望成为临床上治疗肺癌的新选择。