SNPs及其在鱼类遗传育种中的应用

谢嘉木

摘 要：SNPs分子标记是继形态标记、细胞标记、生化标记之后发展起来的一种比较理想的一种DNA标记技术。本文简要介绍SNPs分子标记的特点、基本原理，以及其在鱼类遗传图谱构建、性状关联分析等方面的应用。

关键词：SNPs;鱼类;遗传图谱;性状关联分析

中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）03-0203-02

1 SNPs概述

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）是指在基因组DNA序列中因单个碱基突变导致的多态性。常见的突变类型有单碱基转换、颠换、插入及缺失。假设一种等位基因频率在群体中不小于1%时，即可认定为SNP。在SNP的碱基突变类型中，转换与颠换的频率比为2：1，插入和缺失突变较少。并且转换多以CT为主，出现这种突变的原因主要是甲基化大多发生在CpG岛上的残基C上，C残基极易发生脱氨基化而转变为T，因此CpG岛自然而然成为了突变热点。从理论水平上来讲，SNPs应该涉及到三种多态型：二、三和四等位基因多态性，但实际上后两个是极其稀少的，因此SNPs也常被称为二等位基因（或二态）遗传标记。广泛分布于基因组中的SNPs主要有两种类型：第一类分布在基因的非编码区，第二类分布在基因的编码区（Coding SNPs，cSNPs）。第一类SNPs不会改变蛋白质序列，也不会使个体呈现出突变的表型，却又被广泛应用于群体的遗传变异、物种进化等研究中。第二类cSNPs又可分为同义cSNPs和非同义cSNPs两种类型。同义cSNPs产生的表现型与第一类分布在基因非编码区的SNPs相似，而非同义cSNPs会对呈现出来的性状产生影响，如：改变基因编码的氨基酸序列，进而导致蛋白质功能改变，最终改变其表现型，这种SNPs我们称之为错义cSNPs。此外，cSNPs会提前突变成终止密码子，使得蛋白翻译过程提前终止，进而影响蛋白的功能，呈现与原本不同的表现型，这种SNPs我们称之为无义cSNPs。现有的实验证据显示，在使蛋白质序列发生变化的cSNPs中，其中非同义cSNPs占20%左右。识别和鉴定一个种群内所有个体间的SNPs及其差异性，将能有效获得不同个体生长状态、抗病力及对环境的适应能力等相关信息，为鱼类遗传育种实践提供理论参考，具有重要的实践指导意义。

2 SNPs特点

SNPs特点主要有：（1）密度高。所有动植物的基因组中都广泛存在大量的SNPs，如：在鱼类中，平均每302bp长度的序列中就会出现一个SNP。（2）具备高的遗传稳定性。SNP的形成就是使单个核苷酸碱基发生改变，其突变频率还是比较低的，因此，跟其它多态性分子标记（如：微卫星）相比，其遗传稳定性就高。（3）代表性强。深入研究那些引起蛋白质结构发生改变的cSNPs，有助于我们解析某些疾病的发生机制和遗传机理。（4）易于检测自动化：由于SNPs为双等位标记，只需采用“+/-”或“有或无”的分析方式，就可使得基于SNP的检测方法易于实现自动化。

3 SNPs检测方法

理论上，凡是能检测点突变的技术都可用来检测SNP标记。目前，研究者已开发出很多识别未知或已知SNP位点的方法，每种方法都有它的特点和缺点，在实际应用时采用哪种方法要视研究者自身需求和条件而定。下面将介绍比较常见和经典的检测技术。

限制性酶切片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）：由于DNA限制性酶切所識别的核苷酸序列发生突变，会增加或减少酶切片段的数目，所产片段的大小也会发生变化，最终导致出现DNA多态的现象。具体过程：先用PCR技术扩增相应片段，再用限制性内切酶进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物即可检测到变异的SNPs的变异。该方法优点是简便、快速，缺点是无法高通量检测和发掘SNPs。

单链构象多态性（Single-strand conformational polymorphism，SSCP）：是指由于单碱基突变而引发的小片段单链DNA三维构象的变异而产生的多态性。流程是变性处理扩增获得的DNA片段，使其形成单链。由于序列不同，单链构象就有差异，在中性PAGE凝胶中电泳的迁移率就会不同，通过与标准物的对比，即可检测出是否有SNPs。其优点是方便、经济、检测效率高（80%-90%以上）。

TaqMan探针法（TaqMan Probe）：通过带有TaqMan 标记的PCR引物来扩增目的基因片段，再收集和检测PCR过程中/后产生的荧光信号，从而获得等位基因类型的SNPs，把这种技术称之为TaqMan探针法。此方法优点是无需对PCR产物进行处理，因此其检测速度快;缺点是准确探针的设计。

基因芯片技术（Gene chip）：基因芯片的测序原理是在一块基片表面固定了大量序列已知的靶核苷酸探针，通过杂交、测序获得目标核酸序列，经过信息处理鉴定出SNPs。该方法优点是简单、迅速、自动化的，但其其具有假阳性率高的缺点。

测序法（DNA sequencing）：直接测序是识别SNPs标记的最直接和最常用的方法。简而言之，根据Sanger测序原理，利用测序仪来确定待测分子的DNA序列，通过比较分析进而获得其SNPs位点信息。此方法优点是准确性强，常用来验证其他检测方法的准确度。缺点是样本检测量少，耗时长，成本较高。

4 SNPs在鱼类遗传育种学中的应用

4.1 高密度遗传图谱的构建

遗传图谱是基因组学研究中重要的组成部分，是根据基因组中基因和专一的多态性标记之间的相对位置而绘制出来的图谱，显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置。遗传图谱在基因组结构、功能、进化、质量性状和数量性状基因鉴定等方面的研究中被广泛应用。由于SNP可反应基因位点的多态性，因此可用它来构建高密度遗传图谱。近年来，诸多学者在基于SNPs来构建鱼类遗传图谱的应用研究中取得了较大程度的进展。如：王航俊[1]采用10个SSRs标记和11个SNPs标记对13个群体共367尾中华乌塘鳢进行群体遗传学分析，这些SSRs标记和SNPs标记为不同类群的分类提供了有效的工具。郑先虎[2]基于高分辨率的SNPs标记成功构建了鲤的整合图谱，并与斑马鱼基因组的图谱进行比较分析，结果发现：鲤与斑马鱼之间存在大量保守区域。

4.2 性状关联分析

在常规育种的基础上，借助分子标记对目标性状进行选择，通过分析不同基因型与生长性状进行相关性分析等，可大大减少育种的盲目性。王倩[3]等人分析谷胱甘肽硫-转移酶M基因与鱼类低温耐受性的相关性时，运用PCR-SSCP 技术研究了130尾斑马鱼GSTM 基因5-UTR、3-UTR和第一内含子序列的SNP，同时分析了筛选到的基因型与其低温耐受性状的关联性。研究结果表明GSTM基因SNPs位点与斑马鱼低温耐受性能关联分析提供了依据，也将为海水经济鱼类抗寒标记筛选育种提供参考。王桂兴[4]等人以雌核发育牙鲆（Paralichthys olivaceus）为对象，根据GenBank收录的牙鲆生长激素基因序列设计9对引物，采用直接测序法对50尾雌核发育牙鲆生长激素基因编码区和启动子进行了SNPs筛选，共检测到7个SNPs。经SNPs与生长性状关联分析后，结果表明：只有两个SNPs位点（C477T和2067T/-del）与牙鲆的体重、体长、体高等生长性状明显相关（P<0.05），而其他5个SNPs位点不存在生长性状相关性（P>0.05）。该结果将为牙鲆生长性状的SNPs标记辅助选育提供基础数据和理论参考。

参考文献

[1] 王航俊.基于SSR和SNP标记研究我国沿海中华乌塘鳢的种群遗传结构[D].厦门大学，2012.

[2] 郑先虎.鲤连锁图谱及生长、肉质性状QTL定位研究[D].上海海洋大学，2012.

[3] 王倩，尤锋，辛梦娇，等.斑马鱼GSTM单核苷酸多态性与低温耐受性的相关分析[J].海洋科学，2015，39（1）：1-7.

[4] 王桂兴，等.牙鲆GH基因的SNPs与生长性状关系的初步研究[J].中国水产科学，2015，22（2）：347-352.