井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化

陆佳斌 王银泉

摘 要：此次研究主要通过可以吸水的一种链霉菌井岗变种作为研究对象，通过硫酸二乙酯以及紫外线进行诱变，并通过平皿进行初步筛选，通过摇瓶进行复筛，从而获得高效价菌株，且通过实验研究，此菌株的遗传性较为稳定，同时通过正交实验以及单因素实验对最佳发酵培育基以及发酵条件进行研究和分析。

关键词：井冈霉素;产生菌;诱变选育;发酵条件

中图分类号：Q933

文献标识码：A

农用抗生素是农业常见的应用药品之一，其主要是由微生物形成的一种次级代谢物，能够对农业生产过程中出现的有害生物进行有效的防治，从农用抗生素的作用功能方面进行划分，可分为杀虫抗生素、防病抗生素以及除草抗生素，随着我国对这一类药物的研究不断深入，目前，已经出现了井冈霉素、武夷霉素、农抗120、浏阳霉素等一系列农用抗生素。此次研究的井冈霉素主要是在井岡山发现的微生物菌株所形成的一种农用抗生素，主要用于水稻纹枯病、稻瘟病等，由于其具有低毒、高效以及对环境污染小等优点，因此，被人们广泛应用。然而，此类农用抗生素的生产水平方面仍不高，此问题已经成为当前众多研究人员研究的重点课题，在研究的过程中，高产菌株的选育便是其中的一有效的方法，并且通过发酵培养基及优化培养条件也能够提高其生产水平，本文将对这两方面做出实验研究。

1 实验材料

1.1 菌种的选择

本次实验所选取的菌种为吸水链霉菌井冈变种、水稻纹枯病菌。

1.2 培养基

试管斜面以及孢子活化：高氏Ⅰ号培养基。

发酵培养基：黄豆饼粉3.0%、米粉9.0%、NaCl0.15%、KH2PO40.1%，pH为6.7。

2 实验方法

2.1 诱变选育法

在诱变操作之前应该对单孢子悬液进行制备，并调整孢子的浓度，浓度为108个/mL。

紫外线诱变：取出制备完成的单孢子悬液，将其置入培养皿之中，并将其放置在搅拌器上面，对培养皿与紫外线灯之间的距离进行调整，距离为30cm，然后将培养皿的皿盖打开，然后使用搅拌器进行恒速搅拌，同时使用紫外线灯对其进行照射，照射时间选段分别为0、30、60、90、120、150、180s，当照射完毕之后，对孢子悬液进行梯度稀释，然后进行涂板培养，培养的过程中应该遮蔽光线。

硫酸二乙酯诱变：在紫外线诱变所形成的正变菌株之中选取菌株，保证菌株的效价具备较高的水平，通过此菌株进行硫酸二乙酯诱变，取出最新已制备完毕的出发菌株所形成的孢子悬液，剂量为5mL，将其置入到0.04mL的硫酸二乙酯之中，然后再向其中加入磷酸缓冲液，缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.0，剂量为15ml，并将其放置在摇床上，摇床的温度为37℃，频率为200r/min，然后分别处理0.2、0.5、1.5、6h，处理完毕之后将浓度为2%的Na2SO3加入其中，然后结束诱变，最后将处理完毕的孢子悬液进行梯度稀释，并将其涂板培养，培养过程中仍需要注意避光进行。

2.2 测定效价

测定效价（初筛）：将水稻纹枯病菌作为检定菌。

测定效价（复筛）：测定需要执行《井岗霉素水剂国家标准》（GB/T9553-93），并通过液相色谱法对其效价进行测定。

2.3 效价计算方法

对井岗霉素的效价进行计算的过程中，仍需要执行《井岗霉素水剂国家标准》（GB/T9553-93），并通过液相色谱法对井岗霉素A进行测定，并对试样进行500倍的稀释，同时通过ODS-C18色谱柱以及紫外线检测器分离井岗霉素，并对峰面积应用外标法进行定量，从而使井岗霉素的效价得以算出。

2.4 遗传稳定性检测实验

将通过诱变操作之后形成的高产菌株置于斜面之上，并进行5次的连续传代，并对其代间效价进行检测。

3 结果

3.1 菌株诱变选育的结果

3.1.1 紫外线诱变结果

通过对出发菌株采取紫外线诱变之后，如表1所示，当诱变的时间逐渐增加时，菌株出现的致死率会不断的上升，因此，应该选择在最短的时间之内对菌株进行诱变选育处理，当完成紫外线诱变之后，通过平板初筛后，出现正变菌株共计73株，然后采取摇瓶发酵的方法进行复筛，通过对效价进行检测，共计检测出3株较高效价的菌株，然后进行硫酸二乙酯诱变。

3.1.2 硫酸二乙酯诱变

如表2所示，硫酸二乙酯能够使菌株很容易致死，通过使用硫酸二乙酯进行为时0.2h的处理之后，菌株的致死率能够达到92.6%，但随着时间的增加，致死率虽也在增加，但增加的幅度却极大的降低，而经过上述的30s内对菌株进行紫外线诱变处理之后，在通过硫酸二乙酯进行诱变处理，从而通过选育能够形成高产菌株，通过效价计算为25878×10-6g/mL。同时，通过稳定性实验，结果表明其遗传稳定性较为良好。

3.2 发酵条件的优化

3.2.1 各类碳源、氮源对井冈霉素能力产生的影响

本次研究主要选取6种碳源对发酵培养基之中的碳源进行了替代，这6种碳源分别为碳酸钙、牛肉膏、碳酸氢钠、淀粉、葡萄糖、乳糖，通过实验可知，淀粉效价可达到28089×10-6g/mL，属于6种碳源之中最高的一种碳源（培养基碳源米粉为25869×10-6g/mL）。

同样，此次研究也选取了6种氮源对发酵培养基之中的氮源进行替代，这6种氮源分别为酵母粉、蛋白陈、蚕蛹粉、硝酸钾、氯化铵以及硝酸铵，其中。酵母粉的效价可达到27.68×10-6g/mL，属于6种氮源之中最高的一种氮源（培养基氮源黄豆饼粉为25863×10-6g/mL）。

3.2.2 培养基初始的pH对井冈霉素能力产生的影响

为使各初始pH对井冈霉素能力产生的影响进行对比，通过不相同的pH形成的缓冲溶液用于发酵培养基的配制，通过研究可知，当pH=7.2时，菌株具备最强的产素能力，pH值或高或低都不能够使菌株的产素能力提升，故对pH7.2作为培养基初始的pH。

3.2.3 培养温度对井冈霉素能力产生的影响

当发酵培养基完成接种之后，将其各置入到温度为33℃、35℃、37℃、39℃以及41℃的培养温度环境之中，然后进行摇瓶培养，通过培养结果可知，当培养温度为37℃的情况下，井冈霉素能力便能够达到最强状态。

3.2.4 接种量以及种龄对井冈霉素能力产生的影响

取种龄不同的液体种子参与实验，种龄可划分为60h、72h、84h、96h，通过研究，结果表明种龄与井冈霉素能力之间是正相关的关系，同时，将96h种龄的液体种子以8%、10%、12%、14%的接种量用于发酵培养实验。实验结果表明，接种量为8%的情况下，井冈霉素的能力最强。

3.2.5 正交试验

正交试验依据为L9（34）表，主要对酵母粉、淀粉、NaCl以及KH2PO4这4个因素进行正交试验。通过实验结果可得知其最佳发酵培养基为：酵母粉4%、淀粉12%、NaCl为0.15%、KH2PO4为0.05%，其化学效价可以达到29443×10-6g/mL，以极差作为依据进行分析可知，淀粉对井冈霉素，其次具备较大影响的是酵母粉，而NaCl以及KH2PO4对产素方面的能力具有较小的影响。

4 讨论

随着近年来生物学不断的发展，菌种选育的方法出现了创新，但通过诱变育种这種方法，能够有效的使产素能力得以提升，本文主要通过紫外线诱变以及硫酸二乙酯诱变对菌株进行诱变，通过2次诱变，能够将菌株效价提升至25878×10-6g/mL，此效价要比出发菌株高很多，并且在遗传稳定性方面表现的较为良好。与此同时，在进行液相色谱实验的过程中，对以往通过稀释法进行测定过程中产生的误差大、不易掌握、测时较长等缺陷进行了克服，从而提升产菌的能力。

在诱变选育的前提下，通过培养条件发热优化、培养基配方以及正交试验的实施，能够得出最佳发酵培养基为：酵母粉4%、淀粉12%、NaCl为0.15%、KH2PO4为0.05%，其化学效价可以达到29443×10-6g/mL。从而为井冈霉素的工业生产创造了基础。

参考文献

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作者简介：

陆佳斌（1990- ），男，浙江省海宁市人，本科，研究方向：轻化工程;

王银泉（1962- ），男，浙江省海宁市人，本科，研究方向：生物农药。