植物甾醇提纯与检测优化研究

许腾 陈文洁

摘 要：本试验以植物甾醇保健品为原料，对混合植物甾醇进行提纯精制，并探讨优化提纯方法。其结果表明：对以乙醇为提纯溶剂，利用响应曲面法对提纯工艺进行优化的结果为：料液比1：32.4，结晶温度-9.42℃，养晶时间6.08h，得率66.20%。气相色谱分析，四种甾醇单体含量分别为菜籽甾醇3.28%，菜油甾醇17.01%，豆甾醇23.59%，β-谷甾醇43.86%，总甾醇含量为87.75%。植物甾醇在各种有机溶剂中存在溶解度和吸附力等性质差异，同时，料液比、结晶时间和结晶温度对混合植物甾醇得率有明显影响。

关键词：植物甾醇;提纯;优化

中图分类号：TQ914.1 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）02-0074-03

本试验运用溶剂重结晶法对混合植物甾醇进行提纯，并探讨甲醇、乙醇和丙酮三种不同溶剂的料液比、结晶时间和结晶温度对混合植物甾醇得率的影响，利用响应曲面法优化其提纯工艺，同时气相色谱分析。旨在提供植物甾醇提纯与检测分析试验的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

试剂（均为分析纯）名称：甲醇、无水乙醇、丙酮以及丙酸酐;植物甾醇（市售保健品）。

试验仪器：HH-6数显恒温水浴锅;HERATHERM Oven烘箱;SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵;SOP电子天平;Elmasonic P超声清洗器;7890B气相色谱仪。

1.2 试验设计

1.2.1 溶剂选择和提纯

考虑有机溶剂的安全性、性质差异及稳定性等因素，本试验选用甲醇、乙醇和丙酮為植物甾醇溶剂进行提纯。

1.2.2 重结晶工艺优化

准确称取2.00g植物甾醇放置于250mL圆底烧瓶中加入溶剂，用电磁搅拌水浴回流使样品完全溶解并趁热过滤，冷却静置后真空减压抽滤，置于34℃恒温箱真空干燥、称重，最后计算晶体得率。

采用响应曲面法（Response Surface Methodology，RSM）[3-4]对重结晶工艺优化。通过评估结晶温度（℃），料液比（甾醇质量/溶剂体积，W/V），养晶时间（h）三个单因素对重结晶工艺的影响，进行三个因素五个水平中心组合的优化试验。

1.2.3 气相色谱分析

准确称取2.00g植物甾醇，加入1%胆甾醇-吡啶溶液5.0mL、丙酸酐3.0mL，水浴搅拌回流（80℃），冷却后经0.45μm膜过滤，并置于10mL容量瓶中待衍生化后进行气相色谱分析。色谱柱：DB-5柱（30m×0.25nm×0.25μm）;FID（氢火焰离子检测器），温度300℃;载气：高纯N2，载气流量75mL/min;进样量1μL;试验时，在色谱柱柱温60℃保持2min后，以2℃/min的速度升至100℃，再保持2min后以5℃/min的速度升至270℃，空气流量45mL/min，氢气流量55mL/min，分流比20：1，进样器温度270℃。

2 结果与讨论

2.1 有机溶剂对重结晶的影响

使用甲醇、乙醇、丙酮为溶剂，在相同养晶时间和料液比及水浴回流温度的条件下，对植物甾醇重结晶提纯，得到三类植物甾醇晶体。分析三种溶剂中的晶体形状及得率，无水乙醇得率最高为63.98%，晶形呈白色针尖状;丙酮次之得率为55.26%，晶形呈白色颗粒状;甲醇得率最小仅为9.61%，因溶解度较小的缘故，其晶体呈絮状，颜色浅黄。

2.2 单因素初步试验结果

2.2.1 料液比对重结晶的影响

料液比是植物甾醇质量与溶剂体积的比值。当料液比增加，溶液过饱和度较低，晶体形状较好，有利于提高晶体纯度，但结晶速度会变慢，得率较低;当料液比降低，溶液过饱和度增大，扩散阻力增加，导致晶体易包藏母液，使得结晶纯度不高。

植物甾醇得率在三种溶剂中随料液比的下降而出现先上升后下降的过程，并在料液比1：30时达到最大值。无水乙醇溶液中晶体得率最高为69.75%，而丙酮中的最大晶体得率为68.48%，甲醇溶液最大晶体得率仅为17.48%，这是因为植物甾醇在甲醇中溶解度最小，结晶率不高。因此，后续试验选择料液比为1：30。

2.2.2 结晶温度对重结晶的影响

提高结晶温度有利于晶体扩散，在较高温度下生长的晶体，由于结晶质点排斥外来杂质的能力增强，晶体质量好。但温度过高会导致结晶母液的过饱和度下降，晶体不完全析出，得率下降。相反低温时则晶体生长相对缓慢，杂质析出多，晶体质量受影响。

在三种溶剂中料液比和养晶时间相同条件下，不同结晶温度对植物甾醇晶体影响。重结晶得率均随结晶温度的升高而降低，其中-10℃为最佳结晶温度。

2.2.3 养晶时间对重结晶的影响

分别在2.0h，4.0h，6.0h，8.0h时，评价甾醇重结晶得率受养晶时间的影响。可发现养晶时间对晶体得率影响不大，在约4.0h后趋于平缓，最佳养晶时间为4.0h。

2.3 重结晶优化工艺结果

2.3.1 植物甾醇重结晶响应曲面试验结果

基于单因素试验结果，选定响应曲面试验设计的纯化条件为：料液比1：30、结晶温度-10℃、养晶时间4.0h。以乙醇为例，参照Design Expert软件的分析结果对植物甾醇重结晶工艺进行优化。

使用方差分析进行二次响应面回归模型方程的有效性检验，如表1。可发现，该模型F值为39.14，y（P>F）<0.0001。模型的显著性与y值相关，当y小于0.0500时表明模型影响是显著的，当y值小于0.0100时表明模型影响极显著，因此A、B、AB、BC对整个试验的影响均为极显著。

运用Design Expert软件进行分析，得出最佳提纯工艺：料液比1：32.6，养晶时间6.08h，结晶温度-9.44℃，植物甾醇的重结晶得率为66.22%。

在具体操作中将应用响应面分析法优化后的工艺参数调整为：料液比1：30，养晶时间6.0h，结晶温度-10℃。在此参数条件下进行3次乙醇重结晶试验，得率为67.26%±0.73%，试验结果与回归方程的预测值吻合良好。这表明该模型可优化控制提纯过程的工艺参数。

2.3.2 料液比与结晶温度对重结晶得率的影响

依据回归方程生成料液比与结晶温度的响应曲面分析，得到当乙醇为溶剂时料液比与结晶温度对重结晶得率。当结晶温度确定时，重结晶得率将随料液比增大而先增加（51.08%～64.26%），再逐渐下降（64.26%～59.51%）;当料液比确定时，得率随结晶温度升高而缓慢下降（51.08%～50.23%）。说明料液比与结晶温度有相互作用。

2.3.3 料液比与养晶时间对重结晶得率的影响

根据回归方程生成料液比和养晶时间的响应曲面分析，得到当乙醇为溶剂时料液比与结晶温度对重结晶得率。当养晶时间确定时，重结晶得率随料液比增加而先逐渐增大（48.75%～63.45%），再缓慢下降（63.45%～54.03%）;当料液比确定时，得率随养晶时间的变化趋势较为平缓（48.75%～51.88%），即养晶时间对得率影响小。说明料液比和结晶温度有相互作用。

2.3.4 结晶温度和养晶时间对重结晶得率的影响

根据回归方程生成结晶温度和养晶时间的响应曲面分析，得到当丙酮为溶剂时料液比与结晶温度对重结晶得率。当结晶温度确定时，植物甾醇的重结晶得率随养晶时间的增加先增大后下降（58.43%～64.74%，64.74%～62.85%）;当养晶时间确定时，得率随结晶温度增加而逐渐降低（58.43%～57.08%）。说明料液比与结晶温度有相互作用。

2.4 气相色谱结果

采用标准样品保留时间定性法，以胆甾醇为内标物，通过气相色谱检测混合植物甾醇样品的出峰顺序，依次为胆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。见图1至3。

通过面积归一法计算植物甾醇中各单体含量。以甲醇溶剂对植物甾醇提纯时，菜籽甾醇含量最低，为1.87%，β-谷甾醇的含量最高，为35.66%，总甾醇含量为73.06%。以乙醇溶剂对植物甾醇提纯时，四种单体含量从大到小依次为β-谷甾醇>豆甾醇>菜油甾醇>菜籽甾醇，同时总甾醇含量为87.76%。以丙酮为溶剂对植物甾醇提纯时，豆甾醇和β-谷甾醇含量分别为30.02%和38.01%，较接近，同时总甾醇含量为84.91%。

基于气相色谱分析结果，对甲醇、乙醇和丙酮三种溶剂对植物甾醇的提纯效果进行对比。植物甾醇在甲醇中溶解度小，得率在三种溶剂中最低，不建议用甲醇进行提纯;当以乙醇为提纯溶剂时，各单体含量较均匀，β-谷甾醇含量最多;用丙酮提纯后的植物甾醇纯度也比较高，但会有豆甾醇富集，使得各甾醇单体比例发生变化，如果要使提纯后产品与原料中甾醇组成比例相近，最好不用丙酮为重结晶溶剂。

比较植物甾醇晶体形状发现，晶形粘稠度、聚合度与豆甾醇含量相关，形状差异与β-谷甾醇的含量有关。用甲醇提纯后，晶体呈粘稠状结块，晶形不明显，因为甲醇提纯的β-谷甾醇最少。用丙酮提纯后，晶体粘稠度低、聚合度高，晶形完整，因为丙酮提纯的β-谷甾醇含量较低。使用乙醇提纯后的晶体呈透明细长针形，因为其中β-谷甾醇含量较高。

3 结语

（1）使用溶剂提純得率的高低依次是乙醇，丙酮，甲醇。以乙醇为溶剂，最佳提纯工艺为：料液比1：32.6，结晶温度-9.44℃，养晶时间6.08h，重结晶得率为66.22%;通过Box-Behnken响应设计法分析，植物甾醇和乙醇的料液比（A）、结晶温度（B）及养晶时间（C）对响应值的多元二次响应面回归模型方程为：Y=64.94+2.17A-1.98B+0.49C-9.71 A2-0.86B2-3.42C2-0.17AB-0.72AC+0.27BC。（2）气相色谱分析，植物甾醇出峰时间的先后顺序依次为菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。乙醇溶剂的提纯效果最好，四种甾醇单体含量为菜籽甾醇3.29%、菜油甾醇17.03%、豆甾醇23.59%、β-谷甾醇43.88%，总甾醇含量为87.77%。

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