复合菌种固态发酵法提高甜高粱秸秆饲料品质的研究

■岳 丽 王 卉 山其米克 茆 军 涂振东

(新疆农业科学院生物质能源研究所，新疆乌鲁木齐830091)

甜高粱是一种多用途饲料作物，具有耐旱、耐 涝、耐盐碱、耐瘠薄等优良特性[1-2]。甜高粱的籽粒和茎秆都可用于生产燃料乙醇，因此被视为最有希望的能源作物[3]。甜高粱秸秆制备乙醇后的剩余残渣中仍含有部分脂肪、蛋白质、粗纤维等碳水化合物，可用于制作饲料[4]。甜高粱茎秆残渣的主要成分为木质纤维素，其结构复杂，难于分解[5]。添加纤维素酶可降解部分纤维素，但是纤维素酶生产成本高，不适合大规模使用[6]，通过菌株自身酶系来降解木质纤维素是降低发酵成本的重要手段之一[7]。目前多采用霉菌作为降解纤维菌种，如绿色木霉、康宁木霉、黑曲霉、青霉等[8]。研究表明，利用单菌或单酶对未经处理的木质纤维素进行降解十分困难[9]。因此，如果要充分降解纤维素，需考虑多种微生物之间的协同作用。焦有宙等研究了一种高效的玉米秸秆降解复合菌，发酵后半纤维素的降解率最高达到48.53%，纤维素的降解率为 36.38%，木质素的降解率为40.11%[10]。李明轩以稻草为底物，利用康氏木霉、白腐菌、酵母菌混菌发酵，发酵最终产物中粗蛋白含量从3.49%增加到16.59%，粗纤维含量从44.56%下降到23.17%[11]。通过微生物发酵的手段将甜高粱秸秆转变成蛋白饲料，不仅节约资源，还有利于农牧业的可持续发展。但由于微生物间存在着协同、拮抗等复杂的关系，因此目前研究的重点是不同种属菌种间的配伍能否发挥正协同作用[12]。本研究以甜高粱秸秆酒糟为主要原料，以黑曲霉等菌种为发酵菌种，以提高甜高粱秸秆发酵饲料中粗蛋白质含量，降低粗纤维含量为目标，探索单一菌种及双菌组合对甜高粱秸秆发酵饲料中各物质含量的影响，为发酵甜高粱秸秆生产蛋白饲料提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌种与培养基：新高粱3号酒糟，为新高粱3号秸秆发酵蒸馏乙醇后残渣；麸皮购于北园春市场。白地霉(B)、康宁木霉(K)、产朊假丝酵母(R)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；黑曲霉(H)、枯草芽孢杆菌(C)为本所在实验室保存。供试菌种所用培养基及主要作用见表1。

表1 供试菌种所用培养基及主要作用

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

用无菌吸管吸取0.5 ml的液体培养基于安瓿管中将干燥菌体全部溶解，吸出至含有 4～5 ml液体培养基的试管中，白地霉用麦芽汁培养基，培养3～5 d。康宁木霉用马铃薯培养基，培养5～7 d。枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基，培养2 d。

1.2.2 液体菌种制备

将100 ml液体培养基装入500 ml三角瓶中，接入活化的菌种两环，28℃、120 r/min水浴摇床培养24 h备用。

1.2.3 固态发酵培养

称取100 g甜高粱秸秆酒糟装入三角瓶中，121℃灭菌20 min后，按试验设计，以发酵培养基重的10%（V/W）接入菌种，灭菌后28℃培养72 h，经65℃烘干、粉碎后供分析测定用。

1.2.4 菌种组合发酵试验设计

双菌（接种比例1∶1）混合发酵，见表2，每个组合设3个重复。

表2 双菌组合发酵试验设计

1.3 测定方法

1.3.1 粗蛋白质含量的测定

参照GB 5009.5—2010凯氏定氮法测定粗蛋白质含量。

1.3.2 粗纤维含量测定

参照国标GB/T6434—94酸碱洗涤法测定粗纤维含量。

1.4 单菌种发酵

选取5株菌种，在无菌操作的条件下，向发酵基质中按10%（v/w）接种量接入菌种菌悬液，充分搅拌混匀后，(30±1)℃的条件下，发酵 3 d后，在60℃条件下将发酵产物烘干、粉碎，测定其中的蛋白质含量和粗纤维含量。每个处理做3次重复，对照试验为未接菌的甜高粱秸秆酒糟。

1.5 双菌种发酵

依据单菌发酵试验的结果，筛选出4株菌种，将这4株菌种两两组合进行混菌发酵试验，菌种配比为1∶1，从而确定出适宜的双菌组合配伍，其余操作同1.4节。

2 结果

2.1 单一菌种发酵试验

不同菌种对发酵基质的分解利用程度不同。根据不同菌种发酵后产物中粗蛋白质及粗纤维含量，从而筛选出分解利用甜高粱秸秆基质较好的菌种，结果如图1所示。

图1 不同菌种对发酵产物品质的影响

由图1a可看出，与未接菌的甜高粱秸秆酒糟相比较，白地霉、黑曲霉和产朊假丝酵母发酵产物中的蛋白质含量显著性增加（P＜0.05），增加幅度可达75.32%、65.11%和37.11%，而且增加幅度比其余2株菌株大，这是由于黑曲霉在生长和繁殖的过程当中，会分泌出纤维素酶、果胶酶以及淀粉酶等[13]，这些酶类可以降解甜高粱秸秆发酵基质中的纤维素等，将其转化为小分子的单糖，为微生物生长提供所需的营养物质，促进发酵产物中菌体蛋白积累；而白地霉和产朊假丝酵母的发酵产物中的粗蛋白质含量也显著性升高（P＜0.05），其含量可分别达18.94%、14.81%，这是由于其自身菌体具有较高的蛋白质含量[14]。

由图1b可以看出，产朊假丝酵母、黑曲霉、康宁木霉、白地霉、枯草芽孢杆菌的发酵产物中粗纤维含量较空白组差异显著(P＜0.05)，且康宁木霉、枯草芽孢杆菌降低粗纤维幅度较大，分别降低了36.9%、30.98%，这是因为康宁木霉会分泌一些纤维素酶和半纤维素酶，分解了部分纤维素[15]。

2.1.1 发酵时间对黑曲霉发酵酒糟品质的影响

图2 发酵时间对黑曲霉发酵酒糟品质的影响

从图2可看出，在发酵时间1～9 d内，随着发酵时间的延长，粗纤维含量呈下降趋势，在9 d时达到最低值34.24%；蛋白质含量呈先降低后升高再降低的趋势，发酵时间为7 d时，蛋白质含量达到最高，平均值可达到19.69%。与发酵7 d相比，发酵9 d时蛋白质含量显著降低(P＜0.05)，这可能是由于部分蛋白质分解造成的。综合考虑蛋白质含量和粗纤维含量，发酵时间为7 d时品质较好。

2.1.2 发酵时间对白地霉发酵酒糟品质的影响

由图3可以看出，随着发酵时间的增加，白地霉发酵秸秆酒糟残渣中蛋白质含量显著升高（P＜0.05），这可能是由于白地霉利用发酵基质中的营养成分增殖菌体引起的[16]。粗纤维含量随发酵时间的延长而逐渐减少，这可能是由于白地霉可以合成纤维素酶，降解部分纤维素，引起产物中粗纤维含量逐渐降低。

图3 发酵时间对白地霉发酵酒糟品质的影响

2.1.3 发酵时间对产朊假丝酵母酒糟品质的影响

由不同发酵时间发酵产物中粗纤维含量和蛋白质含量变化曲线（见图4）可以看出：产朊假丝酵母的发酵产物中蛋白质含量在7 d时达到高峰12.73%，随后逐渐下降，可推断产朊假丝酵母在7 d时蛋白酶活力最大。粗纤维含量随发酵时间的延长而逐渐减少。

图4 发酵时间对产朊假丝酵母发酵酒糟品质的影响

2.1.4 发酵时间对枯草芽孢杆菌酒糟品质的影响

从图5可以看出，枯草芽孢杆菌发酵9 d后粗纤维降解率明显高于3 d。从曲线也看出，枯草芽孢杆菌发酵处理第7 d至第9 d时蛋白质含量急剧增加，从14.84%增加到16.59%，相对增加了11.7%。粗纤维含量随发酵时间的延长而逐渐减少。

图5 发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵酒糟品质的影响

2.1.5 发酵时间对康宁木霉酒糟品质的影响

从不同发酵时间产物中蛋白质含量及粗纤维含量的变化情况可以看出(见图6)，经康宁木霉发酵后的甜高粱秸秆酒糟，蛋白质含量呈先升高后下降的趋势，第7 d时蛋白质含量最高。从发酵第3 d到第9 d，康宁木霉处理后秸秆酒糟中的粗纤维含量呈直线下降趋势。

图6 发酵时间对康宁木霉发酵酒糟品质的影响

2.2 双菌组合发酵结果

将不同的微生物进行组合后，不同的组合利用甜高粱秸秆基质的效果将会产生差别，因为它们的互作机制不同，从而导致协同关系有差异[17-18]，所以需要测定不同的双菌组合发酵秸秆酒糟中蛋白质含量和粗纤维含量，从而筛选出最优组合，结果如图7所示。

图7 双菌组合对发酵产物品质的影响

由图7可看出，与空白组相比，6个双菌组合的秸秆酒糟发酵产物中粗蛋白质含量均显著性升高（P＜0.05），粗纤维含量显著性降低（P＜0.05），同时，与相对应的单一菌种发酵产物相比较，双菌组合发酵秸秆酒糟中的粗蛋白质含量均比之高，粗纤维含量均比之低。6种菌种组合中，白地霉和产朊假丝酵母组合，蛋白质含量增加幅度最大，与空白组相比增加了19.43%，但是此组合粗纤维含量高达38.95%。黑曲霉和产朊假丝酵母组合发酵产物中蛋白质含量为18.79%，与白地霉和产朊假丝酵母组合相比，无显著性差异（P＞0.05）；粗纤维含量为34.68%，较未接菌降低了16.38%，且较单一菌种黑曲霉和产朊假丝酵母分别降低了8.15%、7.01%；综合考虑发酵后甜高粱秸秆酒糟中的蛋白质含量和粗纤维含量，黑曲霉和产朊假丝酵母组合协同共生关系最优。

3 讨论

将酵母菌与木霉、黑曲霉或白地霉进行混菌发酵时，双菌组合的粗蛋白含量均高于相应单一菌种。这可能是由于混菌之间可以形成良好的协同共生关系[19-20]，且对合成蛋白酶和纤维素酶的过程具有一定的反馈调节作用，大大增加蛋白酶和纤维素酶的活力[21-22]。同时，分泌的纤维素酶可促进甜高粱秸秆基质中纤维素分解为单糖，促进菌种生长繁殖，增加菌体蛋白，从而提高发酵秸秆酒糟中粗蛋白质含量，降低纤维素含量。

4 结论

①在单一菌种发酵试验中，得出可用于提高发酵高粱秸秆酒糟蛋白质含量的优良菌种为白地霉，分解粗纤维的优势菌种为康宁木霉。

②在双菌组合发酵试验中，综合考虑蛋白质含量和粗纤维含量，可得出黑曲霉和产朊假丝酵母是用于发酵甜高粱秸秆酒糟蛋白饲料的优选组合，发酵7 d后，粗蛋白质含量可达18.79%，粗纤维含量34.68%。