不同酶、菌及复合酶菌制剂对水稻秸秆青贮品质与瘤胃降解率的影响

2019-03-25王玉荣冯文晓李雪玲刁其玉

中国饲料 2019年19期

王玉荣，陶莲，冯文晓，李雪玲，刁其玉 *

（1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，北京海淀100081；2.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300）

反刍动物瘤胃是粗饲料秸秆厌氧消化的场所，瘤胃内具有数量庞大的厌氧微生物（如真菌、古菌、纤维降解菌和原虫等），可将秸杆中的半纤维素、纤维素和含氮物质等降解成自身所需的营养成分（王玉荣等，2016；Kuijk 等，2014；Soest等，1963）。但由于秸秆细胞壁中纤维素-半纤维素-木质素复合结构，导致秸秆饲料的利用率低于65%，不能被充分利用（EFSA，2014）。故研究秸秆青贮饲料在瘤胃内的降解特性至关重要。研究表明，在日粮中添加外源性纤维降解酶可提高动物增重及提高产奶量（陶莲等，2016；刘圈炜等，2011；Bala 等，2009；贾燕霞等，2009；Giraldo 等，2008）。菌制剂处理可以改善饲料的发酵品质，提高营养物质的利用率（Liu等，2016；陶莲等，2016；Ghazali等，2013；Keles等，2011；吕文龙等，2011）。而目前评定营养成分瘤胃降解率的常用方法有体内法、体外法和半体内法，瘤胃尼龙袋法是一种半体内法，可以较客观地反映瘤胃内饲料样品的消化吸收状况，而且能在特定时间测定其降解度和降解率（Liu 等，2016；杨静等，2014）。本试验通过添加酶制剂、菌制剂及复合酶菌制剂对稻秸进行青贮发酵，研究不同处理对稻秸青贮饲料的发酵品质、主要营养成分及其瘤胃降解率的影响，旨在为提高稻秸青贮的质量及利用率提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料水稻秸秆取自吉林省吉林市，品种为稻花香，于2015年9月收获籽粒后收割。采集后的样品经过65℃烘干48 h，粉碎过1 mm网筛，用于化学分析；粉碎过2 mm网筛，用于瘤胃降解试验。

1.1.2 试验添加剂酶制剂：纤维素酶（≥10000 U/g）+木聚糖酶（≥120000 U/g）+β-葡聚糖酶（≥40000 U/g）；果胶酶（≥10000 U/g）、漆酶（≥10000 U/g），粉末状，袋装，试验所用酶制剂均购自夏盛实业集团有限公司，常温贮存。

菌制剂：植物乳酸杆菌（≥2×106cfu/g）、布氏乳酸杆菌（≥2×106cfu/g），菌种保藏于中国农业科学院饲料研究所，菌制剂冻干粉于4℃冰箱贮存。

1.1.3 试验动物与日粮试验选用6头体况正常、体重（67±1.3）kg、装有永久性瘤胃瘘管的健康杜泊×小寒尾羊F1代杂交羯羊，随机分成2组，每组3只羊，每只羊1个重复。于中国农业科学院南口试验基地进行瘤胃降解试验。试验日粮组成及营养水平见表1。试验期间每日于08∶00和16∶00饲喂两次，自由饮水，单圈饲养。

1.2 试验方法

1.2.1 青贮制作本试验共设计9个组，每组3个重复，各样品编号及添加剂量见表2。水稻秸秆刈割后，用青贮切碎揉搓机切短至1～2 cm，按表2处理组及添加剂量溶于蒸馏水，搅拌，均匀喷洒在粉碎的水稻秸秆上，将水分调节至75%～80%。青贮对照组直接添加蒸馏水。样品均装入聚乙烯袋（24 cm×40 cm）中，每袋 1 kg，用真空包装机（DZ-280/2SD）抽真空并封口。原料样品置于冰盒中，迅速带回实验室，-20℃贮藏，青贮样品在室温条件下（25～37℃）贮藏，45 d后开封取样，立即于-20℃保存，待检。

1.2.2 瘤胃尼龙袋法根据Peng等（2013）的瘤胃降解试验方法，准确称取2.5 g左右粉碎后的水稻秸秆青贮饲料样品，分别放入孔径为50μm、大小为10 cm×6 cm的已知重量的尼龙袋中，用尼龙绳距袋口2 cm处系好，每个样品设置2个平行。在饲喂前按照“依次投入，同时取出”的原则，将称好的尼龙袋放入瘤胃中，并用40 cm长的绳子固定在瘤胃瘘管上，放置72 h后取出。每个样品3个重复，每个重复1只羊。取出后的尼龙袋（包括0 h）放在自来水下冲洗，直至水澄清，并在65℃的条件下烘干48 h至恒重，记录残渣与尼龙袋的总重，然后粉碎过1 mm网筛，于封口袋中保存待测。

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表1 试验日粮组成及营养水平（干物质基础）

表2 试验组设计及样品编号

1.3 测定方法

1.3.1 发酵品质及营养成分的测定取水稻秸秆青贮饲料样品20 g，加入180 mL蒸馏水，搅拌均匀，用组织捣碎机搅碎1 min，先后用4层纱布和定性滤纸过滤，滤出草渣得到浸出液，再用pH测定仪（Testo 205型号，德国）测定青贮料浸出液的pH（陶莲，2016）；采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH3-N）含量（陶莲，2016）；使用 GC128型气相色谱分析乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）的含量。检测器 FID，柱 2 m×4 mm，固定相 Pora-pak Q（80目），柱温 220 ℃，汽化室和检测器温度260℃，N2=65 mL/min，Air=550 mL/min，H2=55 mL/min，灵敏度 16×103，纸速5 mm/min。处理前后水稻秸秆的营养成分，包括干物质（DM）、纤维素（C）、半纤维素（HC）、木质素（ADL）、粗蛋白质（CP）、总氮（TN）参见《饲料分析及饲料质量检测技术》进行测定（张丽英，2007）。

1.3.2 瘤胃降解参数及有效降解率参照Ørskov（1980）等提出的瘤胃动力学数学模型，计算公式为：

式中：dP为待测饲料的DM或CP瘤胃某一时间的降解率，%；a为快速降解部分，%；b为慢速降解部分，%；c为慢速降解部分的降解速率，%；t为瘤胃内培养时间，h。

ED/%=a+bc/（k+c）；

式中：ED为待测饲料的有效降解率，%；k为瘤胃外流速率，%/h，本试验中k值取0.031/h（颜品勋，1996）。

1.4 数据处理分析试验数据通过Excel 2016初步整理后，采用SAS 9.2 NLIN程序计算a、b、c值，并利用单因素方差分析（ANOVA）对水稻秸秆青贮原料及发酵后样品的发酵品质、营养成分及瘤胃降解率进行比较。P＜0.05时为差异显著，结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

表3 水稻秸秆青贮原料营养物质含量

2.2 处理后水稻秸秆青贮饲料发酵品质由表4可知，与对照组相比，所有处理组的pH和氨态氮/总氮含量均显著降低（P＜0.05）。乳酸含量在各处理组之间差异显著（P＜0.05），其中CL、CLP及CLPB处理组的乳酸含量显著高于其他处理组（P＜0.05），比对照组分别提高了53.54%、43.59%、54%。LPB、CLP和 CLPB处理组的乙酸含量显著高于其他处理组（P＜0.05），各处理组中丙酸和丁酸含量差异不显著（P＞0.05），在LP处理组中检测到微量丙酸。CL、LP、CLP和CLPB处理组的乳酸/乙酸比例均大于3，其他处理组小于3。水稻秸秆经青贮发酵后，乳酸占总酸含量均达68%以上。

表4 处理后水稻秸秆青贮饲料发酵品质

2.3 处理后水稻秸秆青贮饲料的营养成分由表5可知，DM含量以酶制剂处理组最低（C、PL和CL），与对照组相比分别降低9.31%、3.22%、7.87%（P ＜ 0.05），菌制剂处理组（LP、LB 和 LPB）和复合酶菌制剂处理组（CLP和CLPB）显著高于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，酶制剂处理组、菌制剂处理组和酶菌制剂处理组NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量均显著降低（P＜0.05），但除了PL处理组外，其他处理组CP含量都显著降低（P＜0.05）。木质素含量在各处理组之间差异不显著（P ＞ 0.05）。

表5 处理后水稻秸秆青贮饲料的营养成分

2.4 处理后青贮水稻秸秆饲料的瘤胃降解特性由表6可知，复合酶菌制剂处理组（CLPB）DM快速降解部分显著高于其他处理组（P＜0.05），其比对照组高出51.06%，且酶制剂处理组、菌制剂处理组和复合酶菌制剂处理组DM快速降解部分均高于对照组；复合酶菌制剂处理组（CLPB）的慢速降解部分最高；除酶制剂处理组（C）外，其他处理组DM慢速降解部分的降解速率均显著高于对照组（P＜0.05）。酶制剂处理组（CL）、复合酶菌制剂处理组（CLP）CP快速降解部分显著高于菌制剂处理组（LP、LB、LPB）（P ＜ 0.05），其中复合酶菌制剂处理组（CLP）最高；复合酶菌制剂处理组（CLPB）的CP慢速降解部分最高，为29.23%；复合酶菌制剂处理组（CLP）的CP慢速降解部分的降解速率与其他处理组差异显著（P＜0.05）。

由表6可知，酶制剂处理组（CL）、复合酶菌制剂处理组（CLP、CLPB）的DM有效降解率显著高于其他处理组（P＞0.05），其由大到小顺序依次为CLPB＞CLP＞CL。酶菌制剂处理组CP有效降解率显著高于菌制剂处理组（P＜0.05），其中，CLP处理组最高，为21.03%。

由表7所示，酶制剂处理组（CL）NDF快速降解部分显著高于其他处理组（P＜0.05）；酶制剂处理组（PL）NDF慢速降解部分与对照组无显著性差异（P＞0.05），酶制剂处理组（C）显著低于对照组（P ＜ 0.05），菌制剂（LB、LP、LPB）及复合酶制剂（CLP、CLPB）处理组均显著高于对照组（P＜0.05）；酶制剂处理组（PL）NDF慢速降解部分的降解速率最大。ADF快速降解部分，酶制剂处理组＞复合酶菌制剂处理组＞菌制剂处理组＞对照组；各处理组ADF慢速降解部分均显著高于对照组（P＜0.05）；酶制剂处理组（LP）ADF慢速降解部分的降解速率最大。

表6 处理后青贮水稻秸秆饲料DM、CP的瘤胃降解参数 %

表7 处理后青贮水稻秸秆饲料NDF、ADF、纤维素、半纤维素及木质素瘤胃动态降解率 %

菌制剂处理组（LP、LB）纤维素快速降解部分显著低于对照组（P＜0.05），其他处理组反之；复合酶菌制剂处理组（CLPB）纤维素慢速降解部分最高；菌制剂处理组（LP）纤维素慢速降解部分降解速率最低。半纤维素快速降解部分，除酶制剂处理组（PL）外，复合酶菌制剂（CLPB、CLP）最大；菌制剂处理组（LB）半纤维素慢速降解部分分别显著低于其他处理组（P＜0.05）；各处理组半纤维素慢速降解部分降解速率均显著低于对照组（P＜0.05）。木质素快速降解部分，复合酶制剂处理组（CLPB）最高；木质素慢速降解部分，酶制剂处理组（C、PL、CL）及复合酶制剂（CLP、CLPB）处理组显著高于其他处理组（P＜0.05）；木质素慢速降解部分降解速率，酶制剂处理组（C）最高，为4.34%，复合酶菌制剂处理组（CLPB、CLP）次之，分别为3.46%、4.05%。

NDF有效降解率，酶制剂处理组＞酶菌制剂处理组＞菌制剂处理组＞对照组；除菌制剂处理组（LP、LB、LPB）外，其他处理组均显著高于对照组（P＜0.05）；复合酶菌制剂处理组（CLP）的纤维素有效降解率最高，为31.12%；半纤维素有效降解率，酶菌制剂处理组（CLP、CLPB）显著高于其他处理组（P ＜ 0.05）；除酶制剂处理组（C）外，复合酶菌制剂处理组（CLP、CLPB）木质素有效降解率显著高于对照组（P＜0.05），其他各处理组之间无显著性差异。

3 讨论

3.1 不同酶、菌及复合酶菌制剂处理稻秸青贮饲料对营养成分及发酵品质的影响刘圈炜等（2011）利用酶制剂处理玉米秸秆青贮饲料发现，添加1.0 kg/t水平的复合酶制剂不但能提高玉米秸杆青贮饲料的CP、乳酸含量和乳酸/总酸比例，还能降低其pH、NDF和ADF含量，本试验添加同水平的复合酶制剂处理稻秸青贮饲料所得结果与其大部分一致。贾燕霞等（2009）添加酶制剂处理象草发现，酶制剂处理组的乙酸含量显著低于对照组，本试验与其结果一致。原因可能是酶制剂的添加有利于结构性碳水化合物的水解，可利用糖含量增加（Liu 等，2016）。 Schmidt等（2010）研究结果表明，植物乳杆菌处理组相较于对照组，发酵末期pH显著降低（P＜0.05），DM保存量和乳酸含量显著提高（P＜0.05），纤维素含量和氨态氮/总氮显著降低（P＜0.05），本试验所得结果与其相似。Tabacco等（2011）研究发现，与对照组相比，布氏乳杆菌处理于青贮玉米秸秆pH降低，乳酸生成量减少，乙酸含量显著增多（P＜0.05），乳酸/乙酸比例、乳酸/总酸比例、DM损失量、NDF及ADF含量降低，本试验与其结果一致。有研究表明，植物乳杆菌与布氏乳杆菌联合使用更有利于提高青贮饲料的发酵品质，达到长期保存的效果，原因可能是布氏乳杆菌在青贮发酵过程中占据了主导地位，异型乳酸发酵在产生一分子乳酸的同时，会产生同量的乙酸，而乙酸对好氧微生物有一定的抑制作用，从而提高其有氧稳定性，为乳酸菌发酵提供有利环境（王奇等，2012；吕文龙等，2011）。本试验中，对照组发酵末期的粗蛋白质含量为41.01 g/kg DM，而植物乳酸杆菌添加组为35.75 g/kg DM，在所有处理组中含量最低。由于氮的代谢遵循平衡法则，而且本试验中所有处理组的粗蛋白质含量相较对照组均出现不同程度的降低，故可能由青贮干物质含量增加或氨态氮的变化所致（Comino等，2014）。

本研究发现，酶菌制剂处理组相较其他处理组pH、氨态氮/总氮、纤维素、木质素及粗蛋白质含量最低，乳酸/总酸比例、乳酸含量及DM保存量最高，且未检测到丁酸与丙酸含量，稻秸青贮饲料的发酵品质得到明显改善，营养成分的利用率显著提高（Liu 等，2016）。王奇等（2012）研究发现，与对照组比较，酶菌制剂处理苇状羊茅和箭筈豌豆组的乙酸含量更高，本试验与其研究结果不一致，可能是由于青贮材料和酶制剂的添加成分不同（Schmidt等，2010；贾燕霞等，2009）。本试验中，酶菌制剂处理组，结构性碳水化合物被降解为水溶性碳水化合物，为乳酸菌的发酵提供了底物，同时通过添加植物乳酸菌可增加同型乳酸菌的数量，使其充分的利用酶制剂降解的产物（Ghazali等，2013；王奇等，2012）。另外，酶菌制剂处理组，添加的异型乳酸菌可为乳酸发酵提供稳定的有氧环境，这也体现在酶菌制剂处理组的乳酸/乙酸比例均大于 3（Ghazali等，2013）。由此表明，在发酵品质及营养成分含量方面，酶菌制剂联合使用优于酶制剂及菌制剂的单独添加。

3.2 不同酶、菌及复合酶菌制剂处理稻秆青贮饲料对瘤胃降解特性的影响本试验利用半体内法评定各处理稻秸青贮饲料发现，经不同处理的稻秸青贮饲料的营养物质在瘤胃中降解的难易程度有明显差别。Giralbo等（2008）通过向美利奴羊瘘管中直接添加外源纤维素酶制剂发现，其NDF、ADF、DM含量的瘤胃降解率均无显著差异（P＞0.05），表明酶制剂与纤维类饲料充分作用后，才能保证其在瘤胃内的高效发酵（Kuijk等，2014）。Bala等（2009）在萨能山羊的日粮中添加含纤维素酶和木聚糖酶的酶制剂发现，其可以降低干物质采食量，增加DM、CP、NDF及ADF的消化率，说明酶制剂能有效提高纤维素类饲料在瘤胃内的降解率（陶莲等，2016）。本试验结果发现，纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶及漆酶联合添加进入稻秸青贮饲料，其DM、NDF、ADF、纤维素、半纤维素、木质素和CP的瘤胃有效降解率均显著高于对照组及菌制剂组（P＜0.05），原因可能是酶制剂中含有的纤维素降解酶和木质素降解酶的协同作用，其中果胶酶及漆酶对木质素的苯环骨架进行破坏，纤维素降解酶可破坏糖苷键，共同崩解了稻秸的细胞壁结构，从而降低了瘤胃微生物对细胞壁的抗性，提高了稻秸青贮饲料在瘤胃中的养分消化率（刘圈炜等，2011）。 Keles等（2011）用布氏乳杆菌处理稻秸青贮饲料饲喂美利奴羔羊63 d后发现，布氏乳杆菌处理组相较于对照组，羔羊采食量增加，但体重无明显变化，对NDF含量的瘤胃降解率也无显著影响。Jin等（2015）用布氏乳杆菌添加进入青贮秸秆饲料进行半体内试验发现，相较于对照组，其NDF在瘤胃中的有效降解率提高，但差异不显著（P＞0.05）。本试验所得结果与上述研究基本一致。本试验还发现，菌制剂处理组DM、纤维素的瘤胃有效降解率显著高于对照组（P＜0.05），原因可能是本试验的稻秸预先进行了物理粉碎，故瘤胃微生物对纤维素的酶解效率增加（Ghazali等，2013）。

大量研究表明，利用酶菌联合处理青贮饲料可显著增加饲料主要营养物质的瘤胃有效降解率（解祥学等，2016；陶莲等，2016；Jin 等，2015；Ghazali等，2013；王奇等，2012）。本试验结果表明，复合酶菌制剂处理可提高稻秸青贮饲料中DM、NDF、ADF及纤维素含量的瘤胃有效降解率，高于酶制剂处理组、菌制剂处理组及对照组，与上述研究结果相似，说明酶菌联合使用产生了正效应。其主要原因可能是：（1）酶制剂的添加使稻秸青贮饲料的细胞壁结构崩解，纤维素-半纤维素-木质素复合结构的链接键被打破，提高了纤维素的比表面积及润胀性，降低了细胞壁对瘤胃微生物的抗性，提高了青贮饲料与消化酶的接触面积，使其更易被动物消化（王玉荣等，2016）。（2）酶制剂中含有高效降解纤维素、半纤维素及木质素的酶，在其协同作用下可降低青贮饲料中纤维素含量，从而提高NDF、ADF和纤维素的瘤胃降解率。（3）植物乳酸菌的添加可为发酵过程提供有效活菌种，进而提高乳酸含量，酶制剂可破坏青贮饲料细胞壁将纤维物质转为单糖，为乳酸提供充足的发酵底物。添加布氏乳杆菌会增加青贮发酵的有氧稳定性，使得青贮饲料能长久贮存（解详学等，2016）。